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促丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,是MAP激酶级联信号传递系统(MAPKs)的重要组分。MAPK级联信号传递途径与植物的生长发育以及病原物的侵染、机械损伤、干旱、低温、高盐、渗透胁迫、活性氧、植物激素等各种刺激反应相关联。而MAPK基因的表达受其上游MAPKK基因的调控,并且多个物种已经证明单个MAPKK基因能同时激活多个MAPK基因,分别负责不同的功能信号的传递,其中最根本的两个功能就是胁迫信号和细胞分裂信号的传递。许多研究表明,MAPKK参与低温、高盐等非生物胁迫信号的传递与病原体信号的传导,为MAPK发挥生物学功能起到了至关重要的作用。目前关于MAPKK的研究仅局限于拟南芥、番茄等模式植物,对于棉花中MAPKK基因的研究很少。棉花是我国最重要的农作物之一,具有重大的经济价值和社会效益。本研究以陆地棉(Gossypinm hirsutum L.)(鲁棉22)为材料,利用同源序列,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从棉花中克隆到一个新的MAPKK基因,命名为GhMAPKK。基因全序列测定表明,GhMAPKK基因cDNA全长有1517个核苷酸,包括1050 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),225 bp的5′非编码区(untranslated region,UTR)利208 bp的3′UTR。ORF编码一个349个氨基酸的多肽,其分子量大约为38 kD。cDNA序列与基因组序列比较后发现GhMAPKK基因组序列没有内含子,这属于MAPKK家族中C组或D组的特征。通过序列比对及系统树分析,推导的GhMAPKK氨基酸序列具有植物MAPKK所保守的S/TXXXXXS/T磷酸化位点,N端的第1-32个氨基酸残基构成MAPK结合位点,其特征序列为K/R-K/R-K/R-X1-6-L-X-L/V/I,在静息细胞中MAPKK通过这一位点与MAPK形成复合物;第二个序列是第33-44个氨基酸残基构成的核输出信号序列,该序列富含亮氨酸残基。GhMAPKK氨基酸与来自于拟南芥、烟草、番茄中的几种MAPKK同源性较高。以上结果表明,我们克隆得到的是MAPKK基因。采用Northern blot及定量PCR的方法对GhMAPKK基因在棉花中的表达特性进行了研究。结果表明,GhMAPKK转录水平受机械损伤、高盐、冷害等非生物胁迫诱导而提高;植物抗病反应相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和H2O2也能不同程度的诱导GhMAPKK基因的表达;棉花幼苗受棉花枯萎病菌诱导后,GhMAPKK表达量也有所提高,以上结果证明GhMAPKK可能在自身防卫反应过程中起到重要作用。将GhMAPKK构建正义植物表达载体pBI121-GhMAPKK,采用农杆菌介导的方法转化烟草(Nicotiana benthamiana)。经卡那霉素筛选获得若干再生植株,再经过PCR鉴定,并选取部分转基因植株进行了Northern和Western blot分析,结果证明GhMAPKK在转基因烟草中已成功得到表达。选取两个T0代转基因株系的自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定基础上,对T1代转基因植株进行了生物学功能分析。通过Northern blot获得不同表达水平的转基因株系。以非转基因烟草为对照,过量表达GhMAPKK的转基因植株对植物病原真菌烟草黑胫菌(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)、立枯菌(Rhizoctonia solani Kühn)的抗病能力明显高于对照植株。烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus,TMV)侵染后,转基因植株中有部分株系表现出了明显的抗病性。以上结果表明,我们从棉花中克隆了一个新基因,GhMAPKK。该基因在多种生物胁迫与非生物胁迫反应中起到作用。这一新基因的获得为进一步研究其在棉花抗逆反应中的重要作用,了解植物中MAPKK表达调控模式,确定级联反应途径中各成员之间的相互关系提供了依据。这些研究也是阐明植物对生物胁迫和非生物胁迫分子反应的重要内容,对通过基因工程手段改良植物抗逆性具有实际意义。