【摘 要】
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红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)中的醇脱氢酶(ADH)属中链脱氢酶家族,是一种依赖NADH、专一生成S 型产物的醇脱氢酶,在NADH的帮助下,可以催化苯乙酮生成( S )-苯乙醇,和Lactobacillus kefir中的R 型醇脱氢酶一起,为实现手性芳香醇的工业化生产,提供了可能性.本研究中,用PCR 扩增出红串红球菌Rhodococcus erythropoli
【机 构】
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南京工业大学 生物与制药工程学院,南京,210009
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红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)中的醇脱氢酶(ADH)属中链脱氢酶家族,是一种依赖NADH、专一生成S 型产物的醇脱氢酶,在NADH的帮助下,可以催化苯乙酮生成( S )-苯乙醇,和Lactobacillus kefir中的R 型醇脱氢酶一起,为实现手性芳香醇的工业化生产,提供了可能性.本研究中,用PCR 扩增出红串红球菌Rhodococcus erythropolis ATCC4277 中的醇脱氢酶基因(ReADH),长度1047 bp.构建了pet22b-ADH的表达载体,以BL21(DE3)为宿主进行表达,获得了较好的脱氢酶的重组菌.采用自诱导培养基,以乳糖为诱导剂对重组菌进行培养,15 ℃诱导48 h 后检测酶活,结果得到的重组菌诱导后表达的pet-adh的比酶活为1.4 U/mg,比之前报道的酶活有所提高.同时发现在培养基中添加锌离子以及木糖对产酶是有帮助的.
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本研究以大肠杆菌为宿主菌,对SAM合成酶基因进行克隆.应用PCR技术从E.coli BL21的总DNA中扩增出1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,此基因用于表达融合蛋白,测序证明正确,将其连接到克隆载体PGEMT载体上,再将目的基因插入大肠杆菌高表达载体PET28a中,经双酶切鉴定其连接成功,表明重组子构建成功,为后续高效表达SAM合成酶奠定了坚实基础.
本文利用PCR方法从表皮葡萄球菌基因组DNA中扩增到两条D-乳酸脱氢酶基因(SE2074，SE2121),并连接到载体pET-15b上,构建表达质粒pET-15b-SE2074和pET-15b-SE2121.将重组质粒分别转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导表达.SDS-PAGE电泳分析表明两条D-乳酸脱氢酶基因在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量均约为37 kDa.
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