壳寡糖(chitosan oligosaccharide/chitooligosaccharide,COS),又称低聚葡糖糖胺、低聚氨基葡萄糖等,是一种碱性氨基寡糖,由2-氨基葡萄糖(GlcN,D)通过β-1,4糖苷键连接而成,其中含有部分的乙酰氨基葡萄糖残基(GlcNAc,A)。壳寡糖来源广泛,安全无毒,水溶性好,有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物活性,已引起国内外医药研究者对广泛关注。壳寡糖的生物活性受其聚合度和乙酰度的分布的影响。然而过去有关壳寡糖活性的文献报道中,所用的壳寡糖大都是含有各种聚合度和乙酰度的壳寡糖混合物,而且缺乏相应的结构表征,这给研究壳寡糖的构效关系带来很大的困难。因此,制备特定聚合度和乙酰度的壳寡糖是非常必要的。壳寡糖的生物活性与其糖环上的氨基有重要的关系,所以,全脱乙酰化壳寡糖的制备具有巨大的应用前景。本文建立了一套制备不同聚合度全乙酰化壳寡糖的制备方法。高脱乙酰度壳聚糖的制备:采用水和戊醇作为溶剂,以直接加热和微波加热两种方式用40%的烧碱对壳聚糖原料(脱乙酰度:82.0%)进行脱乙酰化。(1)以水作为溶剂直接加热,在沸水浴中加热搅拌2h,三次平行实验计算得到壳聚糖产物脱乙酰度为85.47%,较原料变化不大;以水作为溶剂微波加热,微波850W下加热反应10min,三次平行试验得到壳聚糖产物脱乙酰为91.96%,但是仍不能得到脱乙酰度大于95%的壳聚糖。(2)以戊醇做反应溶剂直接加热反应1.5-4.5h,可得到壳聚糖脱乙酰度在96.25%~99.00%。壳聚糖脱乙酰反应实质上是酰胺的水解,OH-作为亲核试剂进攻壳聚糖中乙酰氨基水解为氨基。以水作为溶剂得到壳聚糖脱乙酰度较低,其原因主要是因为水的极性较强,使亲核试剂OH-溶剂化,从而大大降低了OH-亲核活性。另一方面,水的沸点较低,而脱乙酰过程需要一定的高温。采用沸点较高但极性较弱的戊醇可以大大促进脱乙酰化反应的进行。以戊醇做反应溶剂微波加热,微波加热5min,反应得到的壳聚糖产物脱乙酰度近90%。与直接加热相比,微波加热不能得到脱乙酰度大于95%的壳聚糖,其原因可能为微波加热时,戊醇溶剂挥发较严重,温度达不到戊醇沸点温度,且没有搅拌也不利于非均相反应进行。综上,微波加热能够促进壳聚糖在水中的脱乙酰化反应,然而一戊醇做溶剂时,微波加热并没有改善脱乙酰反应的进行。以戊醇做为溶剂直接加热可以得到脱乙酰度大于95%的高脱乙酰度壳聚糖。全脱乙酰化壳寡糖的制备:采用高浓度盐酸对制备的高脱乙酰度壳聚糖进行降解。(1)6MHCl。以投料比1:50(m:V)降解0.5-5h,结果发现,降解溶液中仍含有大量固体,说明6MHCl并不能降解高脱乙酰度的壳聚糖。在盐酸降解壳聚糖的过程中,主要进行糖苷键D-D,D-A,A-D的断裂以及脱乙酰化过程。而文献中报道反应速率常数:kAA/AD=54kdeacety=115kDD,由于本实验中所采用的高脱乙酰度壳聚糖中主要为D-D键的断裂,使得降解在6MHCl中几乎不能进行。(2)浓盐酸。同样以投料比1:50(m:V)采用浓盐酸对高脱乙酰度的壳聚糖进行降解,发现随着降解反应的进行,固体的高脱乙酰度壳聚糖逐渐溶解,说明浓盐酸能够对壳聚糖进行降解。我们通过核磁表征降解产物来对降解反应进行追踪,发现当降解进行5h产物1HNMR谱图中乙酰基上的H信号峰完全消失,说明此时降解产物为全脱乙酰化的壳寡糖。而随着反应时间的延长,浓盐酸降解将会导致更多的单糖产生,所以我们采用浓盐酸降解高脱乙酰度壳聚糖5h可得到全脱乙酰化壳寡糖。乙醇分级:醇沉是在多糖分离纯化过程中常用的分离手段,长链的多糖在高乙醇浓度的溶液中溶解度降低而沉淀出来。本实验中采用乙醇分级可以在一定程度上限定壳寡糖产物的聚合度分布。对以上制备的全脱乙酰化壳寡糖用80%乙醇进行分级,可得到两种不同聚合度分布的壳寡糖产物,经HPLC检测后发现,沉淀中壳寡糖聚合度分布为6-16,而上清液主要含有聚合度<7的壳寡糖。