【摘 要】
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目的 在完成骨髓树突状细胞(bone marrow dendritic cell, BMDC)的体外培养、诱导和鉴定的基础上,探讨吴茱萸碱(evodiamine,Evo)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的成熟BMDC功能的影响.方法 BMDC细胞源自4-6周的C57BL/6小鼠.常规脱颈处死小鼠,分离其双后肢股骨内的骨髓细胞进行体外培养一周(RPMI1640+10％FB
【机 构】
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第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042
【出 处】
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2013中国医师协会中西医结合医师大会
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目的 在完成骨髓树突状细胞(bone marrow dendritic cell, BMDC)的体外培养、诱导和鉴定的基础上,探讨吴茱萸碱(evodiamine,Evo)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的成熟BMDC功能的影响.方法 BMDC细胞源自4-6周的C57BL/6小鼠.常规脱颈处死小鼠,分离其双后肢股骨内的骨髓细胞进行体外培养一周(RPMI1640+10％FBS).每隔48h加入GM-CSF(终浓度为25ng/ml),持续诱导7d,使其悬浮细胞或轻微贴壁细胞主要类型为为BMDC.然后分为以下6组进行药物刺激：(1)iDC组；(2)iDC+Evo(10μM)组；(3) iDC+Evo(50μM)组；(4) iDC+LPS(1μg/ml)组；(5)iDC+LPS(1μg/ml) +Evo(10μM)组；(6) iDC+LPS(1μg/ml)+Evo(50μM)组.刺激24h后,取DBA/2J小鼠脾,制备细胞悬液,置于6孔板中,RPMI1640+10％FBS、 37℃、5％CO2培养2-3h,取非粘附脾细胞备用.然后将各组刺激后的BMDC细胞与异原的非粘附脾细胞以1∶16的细胞量进行共培养,4天后用MTT的方法检测其细胞活性.同时,收集多余的BMDC细胞进行膜标记分子(CD11c)、共刺激分子(CD40、 CD80、 CD86)、共抑制分子(PD-L1)和MHC分子(I-A/I-E)；收集细胞上清用于IL-6、 IL-10、IL-12和TNF-α的ELISA检测. 结果 从形态上看,骨髓细胞体外诱导7d后大部分已具备BMDC的多刺状结构,FACS结果显示,悬浮和轻微贴壁细胞中CD11c+的比例约在80％以上,与未加LPS刺激的三组(iDC组和不同浓度Evo干预组)相比,LPS刺激后的三组(iDC+LPS组和不同浓度Evo干预+LPS组)CD40+、CD80+、 CD86+、PD-L1+和I-AA-E的比例都明显升高,其IL-6、IL-10、 IL-12和TNF-α的表达也高于前者各组.相对于仅加LPS组而言,加入不同浓度的Evo对于其表达CD40+、CD80+、CD86+、PD-L1+和I-A,/I-E的水平均有不同程度的降低趋势,而且除IL-10以外,IL-6、IL-12和TNF-α的表达也明显降低,其中高浓度Evo干预对上述各分子以及细胞因子的抑制作用更为明显.在异源淋巴细胞增殖实验中,加入LPS刺激组的细胞活性均比未加入LPS刺激组的要高,而Evo能抑制其激活非粘附脾细胞的增长.结论 BMDC的体外诱导体系正常,可获得纯度较高的BMDC.LPS刺激后的BMDC功能得到活化,可明显激活非粘附脾细胞的增长,而Evo干预能够在一定程度上抑制共刺激分子、共抑制分子、MHC分子、异源淋巴细胞增殖水平以及炎性因子的表达,并且这种作用随Evo干预浓度的增加而加强.提示Evo可以负向影响成熟BMDC的抗原递呈功能,可能是其抗炎作用发挥的另一机制.
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