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目的：棕榈酸诱导MC3T3-E1成骨细胞的凋亡是否与NF-κB的激活有关。
方法：观察不同浓度(0～1000μM)棕榈酸孵育MC3T3-E1成骨细胞24 h后细胞活力和细胞凋亡的影响。细胞活力用MTT法检测,细胞凋亡用Hochest33258染核和western blot检测cleaved easpase-3蛋白验证。用500 μM棕榈酸分别孵育细胞O～240 min,Western blot检测Iκ Bα、p-NF-κB p65蛋白表达。
结果：⑴观察棕榈酸对MC3T3-E1细胞毒性的影响,将不同浓度的棕榈酸孵育细胞24 h或500 μM棕榈酸孵育12～48 h,然后用MTT法检测细胞活力.0～1000μM棕榈酸分别孵育MC3T3-E1细胞24 h,250μM时细胞活力开始下降(P<0.05),500μM时下降为对照组的58%(P<0.01).用500μM棕榈酸孵育12～48 h,12 h细胞活力开始下降(P<0.05),24 h下降为对照组54%(P<0.01).提示饱和脂肪酸棕榈酸使MC3T3-E1细胞活力呈时间和浓度依赖性的下降,明显减少MC3T3-E1细胞的存活率；⑵观察棕榈酸对MC3T3-E1细胞凋亡的影响,采用Hoehest33258染色和caspase-3活性检测细胞凋亡.本研究将500μM棕榈酸分别孵育0、6、12、18和24 h,首先用Hochest33258染核观察,正常对照组细胞的染色质均匀分散于细胞核内,呈均一淡蓝着色,核内结构清楚,核膜光滑,染色质分布均匀.棕榈酸处理组可见部分细胞的染色质出现典型凋亡改变,随着棕榈酸浓度的升高凋亡细胞数目明显增多,凋亡细胞呈不均一的高亮蓝着色,胞核缩小,核膜皱缩,染色质呈边缘化、聚集、皱缩、断裂,晚期染色质碎裂.再用western blot法检测cleaved caspase-3和caspase-3蛋白的变化验证凋亡.经棕榈酸干预后caspase-3表达呈时间依赖性的下降(P<0.05),而cleaved caspase-3表达呈时间依赖性的升高(P<0.05)；⑶探讨棕榈酸对MC3T3-E1成骨细胞的NF-κB信号通路作用,500μM棕榈酸在不同时间点(0、30、60、120和240 min)处理MC3T3-E1细胞,提取全细胞蛋白裂解物,检测p-NF-κB p65、NF-κB p65和I κ B α和tubulin等蛋白的表达.棕榈酸处理后p-NF-κ B p65水平60 min开始升高,在120 min时达到高峰增加2.96倍(P<0.05),随后开始下降.在整个细胞处理过程中NF-κ B p65表达没有明显的变化(P>0.05).棕榈酸处理后I κ Bα表达水平逐渐下降,以120min最为明显下降57%(P<0.05).结果提示经棕榈酸处理MC3T3-E1细胞后,I κ Bα降解,NF-κ B p65激活.4、为了进一步验证NF-κ B信号通路是否参与棕榈酸诱导成骨细胞凋亡,实验先用NF-κ B抑制剂PDTC预孵MC3T3-E1细胞1h,再加棕榈酸孵育24 h,用Western blot方法检测cleaved caspase-3和caspase-3蛋白的变化.10和20μM PDTC能显著抑制棕榈酸诱导的p-NF-κ B p65蛋白水平升高(1.76±0.14 vs 1.39±0.12,1.76±0.14 vs1.25±0.10,P<0.05).与对照组相比,PDTC组的cleaved caflpase-3和caspase-3蛋白表达没有明显改变；500μM棕榈酸组的cleaved caspase-3蛋白表达增加2.24倍(P<0.05),caspase-3蛋白表达则下降37%(P<0.05)；PDTC预孵后cleaved caspase-3和easpase-3蛋白逐渐恢复至接近对照组水平(2.24±0.28 vs 1.29 4-0.27,0,63 4-0.01 vs 1.13±0.10,P<0.05).PDTC能有效地抑制棕榈酸诱导的caspase-3活化提示NF-κB参与棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡。
结论：棕榈酸诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡,主要是通过激活NF-κB途径发挥作用。提示饱和脂肪酸降低BMD可能部分与棕榈酸促进成骨细胞凋亡有关。
方法：观察不同浓度(0～1000μM)棕榈酸孵育MC3T3-E1成骨细胞24 h后细胞活力和细胞凋亡的影响。细胞活力用MTT法检测,细胞凋亡用Hochest33258染核和western blot检测cleaved easpase-3蛋白验证。用500 μM棕榈酸分别孵育细胞O～240 min,Western blot检测Iκ Bα、p-NF-κB p65蛋白表达。
结果：⑴观察棕榈酸对MC3T3-E1细胞毒性的影响,将不同浓度的棕榈酸孵育细胞24 h或500 μM棕榈酸孵育12～48 h,然后用MTT法检测细胞活力.0～1000μM棕榈酸分别孵育MC3T3-E1细胞24 h,250μM时细胞活力开始下降(P<0.05),500μM时下降为对照组的58%(P<0.01).用500μM棕榈酸孵育12～48 h,12 h细胞活力开始下降(P<0.05),24 h下降为对照组54%(P<0.01).提示饱和脂肪酸棕榈酸使MC3T3-E1细胞活力呈时间和浓度依赖性的下降,明显减少MC3T3-E1细胞的存活率；⑵观察棕榈酸对MC3T3-E1细胞凋亡的影响,采用Hoehest33258染色和caspase-3活性检测细胞凋亡.本研究将500μM棕榈酸分别孵育0、6、12、18和24 h,首先用Hochest33258染核观察,正常对照组细胞的染色质均匀分散于细胞核内,呈均一淡蓝着色,核内结构清楚,核膜光滑,染色质分布均匀.棕榈酸处理组可见部分细胞的染色质出现典型凋亡改变,随着棕榈酸浓度的升高凋亡细胞数目明显增多,凋亡细胞呈不均一的高亮蓝着色,胞核缩小,核膜皱缩,染色质呈边缘化、聚集、皱缩、断裂,晚期染色质碎裂.再用western blot法检测cleaved caspase-3和caspase-3蛋白的变化验证凋亡.经棕榈酸干预后caspase-3表达呈时间依赖性的下降(P<0.05),而cleaved caspase-3表达呈时间依赖性的升高(P<0.05)；⑶探讨棕榈酸对MC3T3-E1成骨细胞的NF-κB信号通路作用,500μM棕榈酸在不同时间点(0、30、60、120和240 min)处理MC3T3-E1细胞,提取全细胞蛋白裂解物,检测p-NF-κB p65、NF-κB p65和I κ B α和tubulin等蛋白的表达.棕榈酸处理后p-NF-κ B p65水平60 min开始升高,在120 min时达到高峰增加2.96倍(P<0.05),随后开始下降.在整个细胞处理过程中NF-κ B p65表达没有明显的变化(P>0.05).棕榈酸处理后I κ Bα表达水平逐渐下降,以120min最为明显下降57%(P<0.05).结果提示经棕榈酸处理MC3T3-E1细胞后,I κ Bα降解,NF-κ B p65激活.4、为了进一步验证NF-κ B信号通路是否参与棕榈酸诱导成骨细胞凋亡,实验先用NF-κ B抑制剂PDTC预孵MC3T3-E1细胞1h,再加棕榈酸孵育24 h,用Western blot方法检测cleaved caspase-3和caspase-3蛋白的变化.10和20μM PDTC能显著抑制棕榈酸诱导的p-NF-κ B p65蛋白水平升高(1.76±0.14 vs 1.39±0.12,1.76±0.14 vs1.25±0.10,P<0.05).与对照组相比,PDTC组的cleaved caflpase-3和caspase-3蛋白表达没有明显改变；500μM棕榈酸组的cleaved caspase-3蛋白表达增加2.24倍(P<0.05),caspase-3蛋白表达则下降37%(P<0.05)；PDTC预孵后cleaved caspase-3和easpase-3蛋白逐渐恢复至接近对照组水平(2.24±0.28 vs 1.29 4-0.27,0,63 4-0.01 vs 1.13±0.10,P<0.05).PDTC能有效地抑制棕榈酸诱导的caspase-3活化提示NF-κB参与棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡。
结论：棕榈酸诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡,主要是通过激活NF-κB途径发挥作用。提示饱和脂肪酸降低BMD可能部分与棕榈酸促进成骨细胞凋亡有关。