【摘 要】
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PiggyBac转座子是高效的转基因研究工具,可将外源基因插入到基因组中的TTAA位点,可携带高达150kb进行转座且转基因效率高达10％.本文构建了基于PiggyBac转座子的转基因载体PB-rtTA-NIT-STP,并在小鼠ES细胞系中对载体功能进行验证.该载体含有四环素诱导的tet-on系统调控的SV40T和p53基因、与tet-on系统结合的rtTA转录因子以及用于正负向筛选的LoxP-n
【机 构】
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西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100
【出 处】
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第七次全国动物生物技术学术研讨会暨新疆畜牧科学院第六次学术年会
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PiggyBac转座子是高效的转基因研究工具,可将外源基因插入到基因组中的TTAA位点,可携带高达150kb进行转座且转基因效率高达10％.本文构建了基于PiggyBac转座子的转基因载体PB-rtTA-NIT-STP,并在小鼠ES细胞系中对载体功能进行验证.该载体含有四环素诱导的tet-on系统调控的SV40T和p53基因、与tet-on系统结合的rtTA转录因子以及用于正负向筛选的LoxP-neo-IRES-tk-LoxP基因表达盒.通过构建基于转座子载体PB-rtTA-NIT-STP和转座酶载体PB-transposase的转基因小鼠,获得能够诱导表达SV40T/p53的转基因鼠,通过杂交获得大量转基因小鼠后代,分离其原代细胞并通过四环素类似物多西霉素(Dox)的诱导,在小鼠原代细胞中表达目的基因,实现细胞的永生化,为细胞功能和基因功能研究提供材料.
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食品安全问题由来己久，国家领导人高度重视。动物源性食品安全问题包括病原微生物污染、疫病和兽药残留，中兽医药能够增进国家食品安全的保障能力，研究了其在现代养殖业和促进动物源性食品安全中的应用思路，提倡畜禽健康养殖，保健为主，治疗为辅。
禽类胚胎从受精到形成个体要经过体内和体外两个发育阶段.在体内阶段时,胚胎已发育为含有60000个细胞的X期胚盘.因此,若像哺乳动物那样在受精后的短时间内采集卵子并进行DNA注射或者核移植等技术操作都很困难.本研究通过对采用对X期鸡胚胚盘注射慢病毒的方法成功的获得了输卵管特异表达人溶菌酶的转基因鸡.对进行胚盘注射操作后的鸡胚,我们采用的是Perry的三期培养法,其操作流程包括StageX(EG&K)
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本研究利用TALEN技术成功获得了GGTA1基因敲除克隆猪。与常规的基因打靶技术相比，利用TALEN技术介导的基因敲除效率在单细胞水平可以达到20％-26%之间，而常规同源重组的基因打靶效率仅在10-6～10-7,并且通过一次转染，可以实现一次性双等位基因的敲除，这在常规基因打靶中是无法实现的，这样极大缩短了基因敲除纯合子的培育时间，为生产基因敲除动物提供了极大的便利。另外，利用TALEN技术介导
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构建含有组织特异性启动子的载体,能够实现使外源基因在特定的组织中特异表达;将具有相同或相似功能的转录调控元件结合起来应用,可增强天然启动子的活性.本研究采用肌肉特异性表达基因myf61422bp的启动子(由本课题组保存)序列替换pEGFP-N1的CMV启动子,MyoD CDS序列作为外源基因,构建肌肉特异性表达载体,并且在myf6启动子之前引入SV40增强子,以提高组织特异性表达,在细胞水平验证外