【摘 要】
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利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synths)编码基因gsh 1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastoris x-33,构建了重组菌Pichia pastoris x-33(pGAPZA-gsh 1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性
【机 构】
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江南大学工业微生物中心和工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214036;齐鲁制药有限公司,山东济南,250100
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利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synths)编码基因gsh 1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastoris x-33,构建了重组菌Pichia pastoris x-33(pGAPZA-gsh 1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并采用PCR的方法进行验证.对阳性转化子的γ-glutamyl-cysteine synthas酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-glutamyl-cysteine synthas的酶活力是宿主菌的2.99倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2 mg/L,是宿主菌的1.6倍.
其他文献
准确、迅速和在线测量细胞培养过程中的细胞量是深入研究细胞代谢控制的基础.丝状菌培养液因受不溶培养基以及细胞形态等因素干扰,其生长测定一直无法得到解决.本文对比几种不同细胞生长测定方法,发现流变特性参数随细胞生长呈规律变化,其中表现粘度和稠度系数可以用于丝状菌发酵液细胞生长的表征.
研究了高山红景天悬浮细胞苯丙氨酸氨触酶(PAL)水杨酸(SA)信号转导子对PAL的诱导作用和对红景天细胞生产红景天甙的影响,结果表明,SA加入后24hPAL酶活性出现瞬时提高,其中0.1mM的SA处理后24h后PAL达到最高值,比活为对照的12倍,红景天甙的含量在诱导96h后达到最高,0.01mM的SA促进作用最明显,红景天甙的含量是对照的3.5倍.这些结果说明SA能活化高山红景天悬浮细胞的苯丙烷
研究了NTG的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M18致死率的影响,NTG的诱变剂量25-200μg/ml,处理时间10至30分钟范围内,随着诱变剂剂量增加和时间的延长,微生物的存活率不断下降.NTG的作用剂量25μg/ml,处理时间10分钟时,细菌存活率为55﹪左右.利用细菌存活率为55﹪时的诱变条件,经生物测定,初筛获得20株抑菌效果明显的诱变株.经摇瓶发酵复筛,从这20株诱
PCR扩增了蓝细菌体内偏码ADP-葡萄糖焦磷酸羧化酶(ADPG PPase)的agp基因,通过DNA体外重组,以红霉素抗性基因部分取代agp基因片段,构建了既含agp基因上游及下游序列、又携带选择性标记——红霉素抗生——的pUCAE质粒.该质粒转化野生型集胞藻6803细胞,获得了能在含红霉素的培养基上正常生长的突变株.对该突变株基因组DNA的PCR扩增,结果表明,在agp基因上确实发生了缺失突变.
对漆酶产生菌鸡腿菇C6进行高静水压处理,发现致死率随剂量的增加而增加,在致死率为50％～80％的范围内诱变效果较好.实验获得了一株具有较大应用潜力的鸡腿菇高压突变株C6-203(200MPa处理45min),其酶活比出发菌株提高了256.54％,发酵周期也缩短了1d.
应用低能N+离子束注入红霉素产生菌-红色链霉菌(Streptomyces erythreus)进行诱变选育,结合琼脂块筛选法,经过多轮次诱变筛选,得到高产菌株K79.摇瓶发酵产量由出发菌株的3186u/m1增加到4850u/ml,提高了52.2％.通过对发酵培养基进行了正交试验,在最佳培养基条件下,菌株K79摇瓶产量可达5315u/ml.
离子注入技术近来越来越受到国内外的关注,并被广泛应用于微生物的品种改良.利用N+离子注入法对本实验室保藏的产2,2-二甲基环丙腈水合酶菌种Pseudomonas sp.ZJUT0509进行选育.结果表明,通过离子诱变后的突变株的腈水合酶活性最高可达原始菌株的9倍.对其中F60-4菌种进行产酶条件的优化,其最佳碳、氮源及其用置分别是葡萄糖,2g/l和酵母粉,10g/l,最适初始pH值为6.5,最适发
γ-聚谷氨酸是一种可以通过微生物合成的均聚氨基化合物,具有对人体和环境无毒害、生物可降解性好、可食等优点.本文首先使用PCR方法以高产型枯草芽孢杆菌(Balillussubtilis ZJU-7)的基因组DNA为模板,扩增得到目的基因pgsB、pgsC、pgsA,然后将pgsB、pgsC、pgsA基因定向克隆到质粒pXMJ19上,得到同时具有pgsB、pgsC、pgsA基因的重组质粒pXMJ19-
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通过PCR方法定点诱变并扩增得到温度敏感的T4噬菌体溶菌酶基因ets,与表达载体pUC19连接后转化E. coli JM109,得到重组菌株E. coli JM109(pUC19-ets).重组菌在三角瓶中通过添加IPTG诱导后,悬浮于裂解缓冲液buffer TE中,菌体在10min内吸光度由1.75迅速下降到0.25左右,成功实现了可控裂解.将带有SD序列的T4噬菌体溶菌酶基因ets插入pBV-