Ghrelin是由日本科学家Kojima于1999年发现的目前为止第一个内源性的生长激素促分泌素受体( GHS-R)的配体。Ghrelin作为神经内分泌系统新发现的成员之一,其在刺激GH分泌和能量平衡调节中的地位已被肯定,而生殖活动作为动物机体代谢的特殊活动形式,与机体的能量代谢密不可分;促使我们重新认识Ghrelin在生殖活动中的作用。无论卵泡的生长、发育、成熟、退化和闭锁,黄体的形成以及退化,还是卵母细胞受精后早期胚胎的发育均与能量代谢密不可分,Ghrelin生物学功能在这一方面的积极作用,使我们自然而然的想到,Ghrelin是否参与了上述过程的转录和蛋白水平的剧烈变化并扮演了相应的角色。本论文以绵羊卵巢表达Ghrelin与否为切入点,首次系统的研究了绵羊卵巢以及早期胚胎发育过程中Ghrelin的表达情况,结果如下:1.Ghrelin在卵巢上的表达(1)首先,运用RT-PCR技术证实了Ghrelin mRNA在卵巢上的表达;(2)然后,将绵羊胃组织RT-PCR产物回收,经地高辛探针标记,应用原位杂交技术,检测了Ghrelin mRNA在卵巢中的定位情况,结果显示:Ghrelin mRNA在卵巢上呈广泛性分布,主要定位在原始卵泡、初级卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡中的颗粒细胞及卵母细胞,以及发情周期黄体和妊娠黄体,同时在卵巢表面上皮细胞原位杂交信号强烈;(3)最后,通过免疫组化技术证实,卵巢中Ghrelin在未孕羊卵巢中,卵泡处于早期、生长、发育阶段的卵泡均有Ghrelin的表达。卵泡内卵母细胞Ghrelin免疫染色信号明显强于颗粒细胞。颗粒细胞随着卵泡的发育,免疫组化阳性信号有所增强,而卵母细胞在各级卵泡中持续表达,同时卵巢表面上皮细胞免疫组化染色结果成强阳性。发情周期和妊娠黄体亦成强阳性表达,其中大黄体细胞表达量较高,且集中于各期黄体的大黄体细胞的胞质内,小黄体细胞表达量较少。为防止技术原因造成颗粒细胞表达的偏差我们还通过免疫荧光染色技术,进一步证实了有腔卵泡内卵丘细胞和壁层颗粒细胞是表达Ghrelin的,综合免疫组织化学的结果表明颗粒细胞免疫染色信号弱于卵母细胞。2.Ghrelin mRNA在有腔卵泡内各类型细胞以及各时期黄体的表达变化(1)首先,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测了Ghrelin mRNA在有腔卵泡中(3-5mm)卵母细胞、卵丘细胞和壁层颗粒细胞在排卵/闭锁/退化前的表达变化,结果表明,Ghrelin mRNA表达水平没有显著性差异;(2)然后,应用体外成熟培养技术,每8h检测卵丘细胞Ghrelin mRNA的变化,结果表明Ghrelin mRNA随着卵丘细胞复合体成熟的进程而逐渐下降;(3)最后,通过实时荧光定量RT-PCR分析了发情后第3、9和15天卵巢上的黄体以及妊娠初期、早期、中期和晚期的黄体Ghrelin mRNA变化,结果表明在发情周期和妊娠黄体在形成初期和发育过程均具有较高Ghrelin mRNA表达水平,而在退化阶段均表现出了显著下降的结果(P<0.05)。这种变化与黄体在各时期所展现的功能相适应。3.Ghrelin在绵羊卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的表达(1)本实验通过实时定量RT-PCR技术和免疫荧光染色技术分别对mRNA水平和蛋白水平进行了分析,结果表明,Ghrelin mRNA表达水平在体内外所获得卵母细胞和早期胚胎均呈持续性表达,并呈现出一定动力学变化;Ghrelin亦成广泛性分布。A.在体外成熟后的卵母细胞、2细胞胚胎期和囊胚期胚胎Ghrelin mRNA相对表达量显著高于未成熟卵母细胞,4、8细胞胚胎期和桑椹胚;体内16、32细胞胚胎期和囊胚期胚胎Ghrelin mRNA相对表达量显著高于成熟卵母细胞和2、8细胞胚胎期,未成熟卵母细胞、4,8细胞胚胎期和桑椹胚表达量最低。B.免疫荧光结果表明,Ghrelin在体外未成熟和成熟卵母细胞以及4细胞胚胎期前,绿色荧光信号主要分布于远离胚胎中心的细胞膜及膜下区域;随着早期胚胎的发育,表达量逐渐增加;8细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中绿色荧光信号广泛分布于整个细胞质中;到了扩张囊胚期Ghrelin在内细胞团和滋养外胚层细胞中均丰富地表达。体内所获得的卵母细胞和早期胚胎绿色荧光主要分布于卵母细胞胞质内,并在成熟和卵裂后有所减弱。综合分析,体内所获得的卵母细胞和早期胚胎无论是mRNA水平还是蛋白水平均强于体外所获得的卵母细胞和早期胚胎。(2)进一步检测卵母细胞在成熟过程中Ghrelin mRNA的表达变化,结果表明卵母细胞Ghrelin mRNA随着卵丘卵母细胞复合体的成熟进程而逐渐升高。同时本实验在不同培养基中分别添加LH、FSH和E2,试图追寻是什么导致上述Ghrelin mRNA表达的升高,结果表明,血清和E2对Ghrelin mRNA的表达均有促进作用。本研究利用RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、原位杂交、免疫组织化学和免疫荧光技术检测了绵羊卵巢、早期胚胎Ghrelin的表达情况,研究结果充分表明,Ghrelin存在于卵巢和早期胚胎上,mRNA和蛋白分布均呈现广泛性表达,尤其是在卵母细胞中的表达,为深入研究Ghrelin在卵泡发生、发育以及早期胚胎发育过程中的作用提供了可靠依据,并为人们进一步揭示卵巢功能开辟了又一有益途径。