以能量代谢障碍为病理学基础的酮病和脂肪肝是奶牛在围产期普遍发生的与肝脏脂质代谢相关的营养代谢性疾病。胰岛素受体(InsR)是靶细胞膜上的一种固有糖蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族，即具有受体自动磷酸化激活的酪氨酸激酶活性，它在介导IGF-2和胰岛素信号方面发挥着重要的作用，从而调节动物新陈代谢活动。本文通过饲养实验、体外肝细胞原代培养及定量RT-PCR方法，从细胞和分子水平，研究了围产期奶牛能量代谢状态、神经内分泌因子对围产期正常奶牛、自然发生酮病和脂肪肝病牛胰岛素受体基因表达的调控作用及机理，为防治奶牛酮病和脂肪肝等围产期能量代谢障碍性提供实验和理论依据。 在正常奶牛饲喂试验中，选取24头5-8岁、3-5胎泌乳量大于5000Kg的妊娠荷斯坦奶牛，集中单槽饲养，预饲一周后进行饲养试验。试验期由产前第28d至产后56d结束，按中国奶牛饲养标准配制的产奶日粮饲喂。产前奶牛每公斤日粮含1.79NND，产后各组奶牛常规方式饲喂精料，自由摄食干草，整个试验期间每日早、中和晚定时饲喂。根据血糖水平，将整个试验期奶牛分为低血糖组和正常血糖组。在试验期产前28d、14d和产后1d、14d、28d及56d，分别采集血液，测定血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、血清游离脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)、总胆红素(TBI)、谷草转氨酶(AST)、胰高血糖素(GN)、胰岛素(INS)等指标。在自然发病奶牛试验中，选取自然发生酮病牛10头、脂肪肝病牛13头和正常对照组13头。分别采取血液，测定项目除上述指标外，增加了血清尿素氮(BUN)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、胆碱酯酶(CHE)、肌酐(Cr)。采取肝组织和尾根部脂肪，同时称量周体重(BW)、日平均泌乳量(MY)和日平均饲料消耗量，计算干物质摄入量(DMI)。结果表明：①围产期奶牛易发生低血糖，表明存在能量负平衡(NEB)，发生NEB的奶牛大多能在产后28d左右恢复正常；②围产期奶牛血浆NEFA明显增加，产后1d血浆NEFA、TBI浓度达最高，产后14d血清BHBA、AST达到最高，随后逐渐降低，说明围产期分娩前后奶牛脂肪动员先增强后减弱；围产期奶牛发生NEB将加剧奶牛脂肪动员，促进亚临床酮病的发生；③围产期奶牛调节糖原异生、脂肪动员的血液激素GN、INS及其INS/GN比率都逐渐降低，尤其INS/GN比值明显下降(＜0.10)，启动了脂肪动员和肝糖异生作用；④酮病、脂肪肝奶牛泌乳量明显下降，血糖显著降低，血浆NEFA和BHBA明显增高；酮病、脂肪肝奶牛肝脂含量分别为18.8％和41.9％。酮病奶牛血清AST、γ-GT、TBI、CHE等多项指标呈现升高的趋势，提示可能存在肝功能不全。脂肪肝奶牛血清AST、γ-GT、TBI、CHE等多项肝功能指标明显增高，表明其肝功能不全。血清Cr显著升高，显示肾功能可能也受到影响。 根据GENEBANK发表的牛InsR、β-actin的cDNA序列，设计两对引物，分别成功扩增出147bp的InsR基因片段和351bp的β-actin基因片段，分别构建含牛InsR基因、β-actin基因的载体，测序结果InsR、β-actin目的基因的同源性分别达到95％、100％。建立和优化了肝InsRmRNA半定量RT-PCR检测方法，其适宜的PCR反应条件：退火温度为60℃、Mg2+终浓度为2.4mmol/l、循环次数为30次、cDNA最小检测限为5.2ng/ml，反应体积25ul。选择摄入不同能量的围产期24头奶牛的肝脏和脂肪组织，自然发生酮病奶牛、病死的脂肪肝奶牛和正常对照组围产期奶牛各5头的肝脏组织样品，利用半定量RT-PCR检测方法，观测了InsR基因的表达变化。结果表明：①干乳期高能饲喂，下调产后奶牛肝脏和脂肪组织InsRmRNA丰度，脂肪动员增加，血液中NEFA及酮体浓度高，加重产后奶牛能量负平衡。干乳期低能饲喂，上调产后奶牛肝脏和脂肪组织InsRmRNA丰度，抑制脂肪动员，促进糖原合成，维持血糖浓度相对恒定，缓解机体能量负平衡，提高奶牛的生产性能。这些变化与血液INS、GN和INS/GN的变化有关。②酮病组奶牛InsRmRNA表达下降，提示此有利于酮病奶牛糖异生和脂肪动员，从而缓解能量负平衡；脂肪肝奶牛InsRmRNA相对表达量显著降低，提示奶牛胰岛素应答显著减弱，此时奶牛可能发生了胰岛素抵抗。 同时，采用体外牛肝细胞原代培养技术和牛肝InsRmRNA半定量RT-PCR检测方法，观测了添加不同浓度的胰岛素(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol/l)、胰高血糖素(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol/l)对新生犊牛原代培养肝细胞培养12h后肝细胞InsRmRNA的表达水平。结果表明：①随着胰岛素浓度的升高，肝细胞InsRmRNA表达的丰度随之减弱，呈现剂量依赖性。胰岛素能抑制体外培养肝细胞InsRmRNA的表达。②随着胰高血糖素浓度的升高，肝细胞InsRmRNA表达的丰度呈现锯齿状不规则的变化，各浓度之间差异不显著。结果显示：胰高血糖素对肝细胞的InsRmRNA的表达水平未产生直接影响。