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大肠杆菌病是大肠杆菌引起的一类重要动物传染病,给畜牧业造成巨大的经济损失。该病主要用抗生素防治,但抗生素的长期、盲目使用不仅导致耐药菌株流行、疫病防治难度加大,而且导致耐药基因水平传播,因此深入研究动物源大肠杆菌及其耐药性不仅有助于动物疫病防治,而且具有重要的公共卫生意义。本研究从送检到扬州大学动物医院的动物病料中分离到353株大肠杆菌,对其药物敏感性、耐药基因和系统进化分群进行研究,进行多位点序列分型,旨在进一步了解我国动物源耐药大肠杆菌的流行现状,阐明耐药性产生和传播的分子机制,为指导兽医临床合理用药和控制耐药基因水平传播提供科学依据。1.动物源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测在2017年期间,从扬州大学动物医院收集江苏及周边地区送检的病（死）鸡、鸭、鹅、猪、牛和其它动物病料,通过细菌分离培养、染色镜检和生化试验分离到353株大肠杆菌。用纸片扩散法对15种药物进行药敏试验,结果显示97.2%分离菌株对一种或以上抗菌药物耐药,72.2%对三种或以上药物耐药。在353株大肠杆菌临床分离株中,复方新诺明和多西环素耐药菌株的比例最高,分别占81.9%和81.6%。在160株鸡源大肠杆菌中,复方新诺明和多西环素耐药菌株各占86.9%;在67株鹅源大肠杆菌中,多西环素和美洛西林耐药菌株各占88.1%;在46株猪源大肠杆菌中,复方新诺明耐药菌株占84.8%。大肠杆菌耐药率与临床用药密切相关,用药较多的禽源分离株的耐药率显著高于用药较少的猪、羊、犬等动物分离株。不同动物源大肠杆菌的具体抗生素耐药率存在显著差异,鸡源大肠杆菌对链霉素的耐药率显著高于猪源和其它动物源大肠杆菌,鹅源大肠杆菌对头孢曲松的耐药率显著高于鸡源、猪源和其它动物源大肠杆菌,猪源大肠杆菌对卡那霉素和左旋氧氟沙星的耐药率显著高于鸡源和其它动物源大肠杆菌,鸡源、鹅源、猪源大肠杆菌对卡那霉素、复方新诺明、氟苯尼考和多西环素的耐药率显著高于其它动物源大肠杆菌。2.动物源大肠杆菌的耐药基因检测分析用PCR对353株大肠杆菌的氨基糖苷类耐药（Aminoglycoside resistance,AGR）、质粒介导氟喹诺酮类耐药（plasmid-mediated fluoroquinolone resistance,PMQR）和超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase,ESBL）耐药基因进行系统检测。在353株大肠杆菌中有110株为AGR基因检测阳性,其中aac（3）-Ⅱ阳性菌株比例最高（20.1 1%）,aac（6’）-Ib阳性菌株次之（13%）,armA 阳性菌株最低（1.1%）,7株同时携带aac（3）-Ⅱ和aac(6’-Ib,2株同时携带aac（3）-Ⅱ和armA,1株同时携带aac（3）-Ⅱ、aac（6’）-Ib和armA。在353株大肠杆菌中有39.4%为PMQR基因检测阳性,其中26.9%为qnrS阳性菌株,10.8%为aac（6）-Ib-cr阳性菌株,4.5%为qnrB阳性菌株,3.4%为qnrD阳性菌株,0.3%为qepA阳性菌株,未检测到qnrA阳性菌株。其中同时携带aac（6’）-Ib-cr和qnrS基因的阳性菌株有9株,同时携带aac（6）-Ib-cr、qnrS、qnrB和qnrD基因的阳性菌株有2株。在353株大肠杆菌中有44.8%为ESBL耐药基因检测阳性,其中20株携带2种ESBL耐药基因,36.5%菌株为TEM基因检测阳性,5.1%为CTX-M-1基因检测阳性,8.2%为CTX-M-9基因检测阳性。在上述三类耐药基因检测阳性菌株中,30.6%携带两类及以上耐药基因。在158株ESBL基因阳性菌株中有26.6%同时携带PMQR基因,22.2%同时携带AGR基因,另有17株同时携带三类耐药基因。耐药表型与基因型相关性分析结果显示,353株大肠杆菌的妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和庆大霉素的耐药表型与基因型符合率较高,分别为97.30%、89.35%、89.15%和77.45%。不同动物源菌株的耐药基因型与表型符合率有所差异,鸡和鹅源菌株的左氧氟沙星耐药表型与基因型符合率显著高于猪源菌株,猪和鹅源菌株的庆大霉素耐药表型与基因型符合率显著高于鸡源菌株。3.多重耐药大肠杆菌的系统进化分群与多位点序列分型以chuA、yjaA和TSPE.C2为靶基因对鸡、鹅和猪源大肠杆菌分离菌株进行系统进化分群,结果显示160株鸡源和67株鹅源菌株的优势菌群为A,分别占43.1%和44.8%,其次是B1,分别占28.8%和28.4%;46株猪源大肠杆菌的优势菌群为B1,其次是A;系统进化分群A、B1、B2和D群在鸡、鹅和猪源分离菌株数量之间无显著性差异。卡方分析结果显示A群鸡源菌株含一或两类耐药基因的比例显著高于B2和D型菌株,A群鹅源菌株含一或两类耐药基因的比例显著高于B2菌株,B1群猪源菌株含一或两类耐药基因的比例显著高于B2菌株。为了调查多重耐药性大肠杆菌临床分离株的基因型特点,从353株大肠杆菌中筛选出28株多重耐药菌株,根据adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA等持家基因PCR检测及序列测定结果进行多位点序列分型（Multi-locus sequencetyping,MLST）,结果显示28株菌株有19种ST型,其中ST155、ST156、ST354均有3株菌株;此外有13株鸡源大肠杆菌可分为11个ST型;15株不同动物源大肠杆菌分属11个不同的ST型。这些结果提示不同动物源多重耐药大肠杆杆菌具有ST型多样性。综上所述,大肠杆菌是感染动物的常见病原,临床分离菌株的耐药性和多重耐药性比较高,而且这些多重耐药菌株携带多种耐药基因,这些菌株可能成为潜在的耐药基因贮存库。系统进化分群和多位点序列分型研究结果表明显示多重耐药菌株可能也是潜在的人兽共患病病原。因此,监测动物源性大肠杆菌有其重要的公共卫生意义,同时,了解动物源性大肠杆菌耐药基因对兽医临床合理用药和控制基因水平传播具有重要意义。