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研究背景和目的新城疫病毒(Newcasle disease virus, NDV)治疗肿瘤作为一种潜在的生物治疗方法,已经逐渐用于肿瘤治疗的基础和临床研究。我们在江西鄱阳湖野鸭中分离得到NDV野生毒株(命名为WDK/JX/7793/2004,简称NDV7793),依据多重RT-PCR电泳和基因序列分析结果确定其为NDV弱毒株的一员。我们课题组前期实验结果显示,NDV7793瘤内注射可明显抑制人小细胞肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,该作用可能与其上调肿瘤细胞Bax蛋白的表达有关；还发现NDV7793腹腔注射,对小鼠结肠癌的肝转移同样具有明显的抑制作用,这可能是通过纠正肿瘤微环境中Thl/Th2细胞比例失衡,以及通过提高胸腺指数等途径来抑制结肠癌的肝转移。然而,NDV7793瘤内注射,除通过改变皮下移植瘤肿瘤微环境来抑制肿瘤生长的作用外,尚未明确NDV7793瘤内注射能对皮下移植瘤的浸润、转移产生影响。本课题旨在研究NDV7793瘤内注射对小鼠肺腺癌皮下移植瘤的治疗效果；初步探讨NDV7793瘤内注射对小鼠肺腺癌皮下移植瘤肿瘤浸润、转移的影响及其相关机制。研究内容和方法1.通过CCK-8实验检测NDV7793对LLC细胞的杀伤作用体外培养LLC细胞,分别将不同效价的NDV7793及不同浓度的顺铂进行分组处理,作用时间结束,加入CCK-8试剂,检测各组细胞OD值。2.小鼠肺腺癌皮下移植瘤模型的建立常规培养小鼠肺腺癌Lewis细胞(简称LLC)。小鼠右腋皮下注射1×106个LLC细胞建立肺腺癌皮下移植瘤模型。3.研究NDV7793对小鼠肺腺癌皮下移植瘤的疗效分组给药：将肺腺癌皮下移植瘤模型小鼠随机分为PBS阴性对照组,顺铂阳性对照组,NDV7793组。用重复测量法分析各组药物对小鼠肿瘤体积的影响,对各组小鼠进行生存分析,比较各组抑瘤率。4.观察肿瘤浸润、转移情况比较小鼠右腋下淋巴结、皮下癌旁组织肿瘤浸润及胸腔转移情况。5.检测小鼠肿瘤组织CCL19、CCL21表达水平ELISA方法分别检测肿瘤组织上清液CCL19、CCL21表达水平。6.NDV7793对肺腺癌皮下移植瘤模型小鼠肿瘤组织T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达、LLC细胞CCR7蛋白表达的影响流式分别检测肿瘤组织T细胞占TILs细胞比例、CCR7+LLC细胞占LLC细胞比例及CCR7+T细胞占T细胞比例。7.分析各组小鼠肿瘤组织CCL21表达水平与T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达、LLC细胞CCR7蛋白表达的关系将所有组别的小鼠肿瘤组织T细胞/TILs细胞比例、CCR7+LLC细胞/LLC细胞比例及CCR7+T细胞/T细胞比例分别与肿瘤组织CCL21水平进行相关性分析。8.分析各组小鼠肿瘤组织LLC细胞CCR7蛋白表达与T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达的关系将小鼠肿瘤组织CCR7+LLC细胞/LLC细胞比例分别与CCR7+ T细胞/T细胞比例、T细胞/TILs比例进行相关分析。9.检测肿瘤组织CEACAM1蛋白的表达水平流式细胞术检测各组肿瘤组织CEACAM1+细胞占肿瘤组织细胞比例；免疫组化实验比较各组小鼠肿瘤组织CEACAM1表达水平。10.分析肿瘤组织CEACAM1表达水平与CCL21蛋白表达、T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达、LLC细胞CCR7蛋白表达的关系将所有组别的小鼠肿瘤组织CEACAM1+细胞占肿瘤组织细胞比例分别与CCL21蛋白表达、T细胞/TILs细胞比例、CCR7+LLC细胞/LLC细胞比例及CCR7+T细胞/T细胞比例进行相关分析。研究结果1.作用时间为48小时,不同效价的NDV7793和不同浓度的顺铂均对LLC细胞有杀伤作用,其中NDV7793组(最低效价1：64)和顺铂组(最低浓度0.0025mg/mL)的OD值均小于空白对照组,P<0.05,差异有统计学意义。2.成功构建小鼠肺腺癌皮下移植瘤模型,建模成功率为96%(48/50)。3.NDV7793对小鼠肺腺癌皮下移植瘤的治疗效果1)对肿瘤体积生长分析可得：给药期间,与PBS阴性对照组相比,NDV7793组和顺铂阳性对照组可减缓小鼠肿瘤体积的生长速率,P<0.05,差异具有统计学意义,且NDV7793组较顺铂阳性对照组对小鼠肿瘤体积生长的抑制作用更强。2)对各组小鼠进行生存分析可得：NDV7793组生存期显著长于PBS阴性对照组,P<0.05,差异具有统计学意义；但顺铂阳性对照组的生存期与PBS阴性对照组相比较,P>0.05,差异无统计学意义。3)对各组抑瘤率统计分析可得：给药期间,与PBS阴性对照组比较,NDV7793组和顺铂阳性对照组小鼠肿瘤均被抑制,且NDV7793组的抑瘤率高于顺铂阳性对照组。4.NDV7793对小鼠肺腺癌皮下移植瘤癌旁组织、右腋下淋巴结浸润及胸腔转移的影响病理学观察：PBS阴性对照组小鼠癌旁组织均发现癌细胞浸润,且部分小鼠癌细胞已浸润到小鼠右腋下淋巴结；顺铂阳性对照组部分小鼠癌旁组织发现癌细胞浸润,右腋下淋巴结未见癌细胞浸润;NDV7793组小鼠,癌细胞未浸润癌旁组织及右腋下淋巴结。三组小鼠均未发生胸腔内转移。5.肿瘤组织CCL21表达水平显示：NDV7793组小鼠肿瘤组织的CCL21表达水平明显高于PBS阴性对照组,P<0.05,差异具有统计学意义,顺铂阳性对照组与PBS阴性对照组相近,P>0.05,差异无统计学意义。6.肿瘤组织CCL19表达水平显示：PBS阴性对照组、NDV7793组及顺铂阳性对照组CCL19表达水平无明显差异,且肿瘤组织的CCL19表达水平较CCL21表达水平低。7.流式细胞术检测肿瘤组织LLC细胞CCR7表达结果显示：与PBS阴性对照组相比,NDV7793组小鼠肿瘤组织CCR7+LLC细胞占LLC细胞比例下降,P<0.05,差异具有统计学意义,而顺铂阳性对照组与PBS组比例相近,P>0.05,差异无统计学意义,说明NDV7793组较PBS阴性对照组及顺铂阳性对照组小鼠肿瘤组织LLC细胞CCR7表达水平更弱。8.流式细胞术检测肿瘤组织T细胞浸润情况及T细胞CCR7表达结果显示：NDV7793组T细胞/TILs比例大于PBS阴性对照组及顺铂阳性对照组,P<0.05,差异具有统计学意义；而NDV7793组及顺铂阳性对照组CCR7+ T细胞/T细胞比例明显小于PBS阴性对照组,P<0.05,差异有统计学意义。9.分析各组小鼠肿瘤组织CCL21表达水平与T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达、LLC细胞CCR7蛋白表达的关系：结果表明CCL21表达水平与CCR7+LLC细胞/LLC细胞比例呈明显负相关,r=-0.589,P<0.01,相关系数有统计学意义,与T细胞/TILs比例、CCR7+ T细胞/T细胞比例无关。10.分析各组小鼠肿瘤组织LLC细胞CCR7蛋白表达与T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达的关系：结果表明小鼠肿瘤组织CCR7+LLC细胞/LLC细胞比例与T细胞/TILs比例呈负相关,r=-0.503,P<0.05,相关系数有统计学意义,与CCR7+ T细胞/T细胞比例无关。11.流式细胞术检测肿瘤组织CEACAM1表达水平显示：NDV7793组小鼠肿瘤组织的CEACAM1+细胞/肿瘤组织细胞比例低于PBS阴性对照组(P>0.05),低于顺铂阳性对照组(P<0.05),差异具有统计学意义。12.免疫组化检测肿瘤组织CEACAM1表达水平显示：顺铂阳性对照组小鼠肿瘤组织CEACAM1表达水平较PBS阴性对照组及NDV7793组强,且NDV7793组较PBS阴性对照组小鼠肿瘤组织CEACAM1的表达水平更弱。13.分析各组小鼠肿瘤组织CEACAM1与CCL21表达水平、T细胞浸润、T细胞CCR7蛋白表达、LLC细胞CCR7蛋白表达的关系：结果表明小鼠肿瘤组织CEACAM1+细胞/肿瘤组织细胞比例与T细胞/TILs比例呈明显负相关(r=-0.601,P<0.01),与CCR7+LLC细胞/LLC细胞比例呈明显正相关(r=0.584,P<0.01),相关系数有统计学意义,与CCL21、T细胞CCR7蛋白表达无关。结论1.NDV7793和顺铂对LLC细胞均具有杀伤作用。2.NDV7793对肺腺癌皮下移植瘤小鼠的疗效比顺铂更好,不仅延长小鼠生存期及抑制肿瘤生长,而且对肿瘤的浸润、转移也有一定的抑制作用。3.NDV7793对肺腺癌皮下移植瘤小鼠肿瘤生长、浸润、转移具有抑制作用,可能与NDV7793诱导肿瘤微环境CCL21表达,抑制CEACAM1表达,促进T细胞向肿瘤组织浸润,抑制肿瘤LLC细胞及T细胞CCR7蛋白表达有关。