研究背景癫痫是一种常见疾病,据流行病学调查,人群年患病率为7‰,严重危害人类健康和生活质量。目前癫痫的治疗虽然取得了一些进展,如各种新型抗癫痫药物、迷走神经刺激术和不断进步的外科手术治疗,但仍有20%-40%患者的癫痫发作不能得到有效控制,成为难治性癫痫。生酮饮食(ketogenic diet, KD)是一种高脂肪、低碳水化合物和适量蛋白质的饮食方案。自1921年Wilder等报道了用“生酮”来治疗难治性癫痫以来,KD的疗效已经被大部分学者认同,并且在一些临床中心应用。但是,KD起效周期较长,需要长期改变患者饮食习惯,并可能导致高血脂,低血糖和肾结石等并发症,临床依从性较差。因此,研究者们不断在寻找与KD具有相似的抗癫痫机制、可替代KD,并且副作用小、依从性好、能应用于临床的药物。1,6-二磷酸果糖(fructose-1,6-diphosphate, FDP)是细胞内天然存在的一种化合物,已经广泛应用于心、肾、肝、脑缺血等的临床治疗,未发现明显副作用。FDP与KD类似,具有抑制糖酵解的作用,并且能增加细胞对抗氧化应激的能力。在难治性癫痫中,以逐渐发展的癫痫反复发作和海马硬化为特点的颞叶癫痫最为常见。而电点燃模型是用一定强度的电流反复刺激特定脑区,导致癫痫发作活性不断增强,最终形成稳定的癫痫发作状态,是研究颞叶癫痫的理想模型。海马快速电点燃模型建立周期短,干扰因素少,在药物筛选上敏感性较高；而杏仁核慢性电点燃模型发作情况更易于控制,重复性好,对刺激反应的耐受性好,死亡率低,除了可以更细致地评价抗癫痫药物的作用,还能较好地研究抗癫痫药物的副作用和药物机制。因此,我们选用这两种模型进行本实验的研究。突触结构和功能的变化是颞叶癫痫的主要病理基础,其在电点燃模型中扮演很重要的角色。脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)在中枢神经系统许多区域表达并参与突触重塑和神经递质的传递功能,与癫痫的形成关系密切。研究发现,糖酵解过程中的产物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可在转录因子神经元限制性沉默因子的协助下与活性升高的C-端结合蛋白结合。因此,抑制糖酵解可降低与癫痫密切相关的基因的表达,这些基因中就包括与突触可塑性密切相关的基因BDNF.而另外有研究发现BDNF通过激活酪氨酸激酶B受体(tyrosine kinase receptor B, TrkB)调节钾-氯离子共转运体2(K+-Cl- cotransporter 2,KCC2)和钠-钾-氯离子共转运体1(Na+-K+-2Cl- cotransporter 1, NKCC1)的表达,从而调节γ-氨基丁酸A型受体的功能向兴奋性转化,并参与了神经兴奋毒性。但是到目前为止,国内未见关于BDNF介导的FDP抑制癫痫作用的相关机制研究。因此本研究从电点燃模型入手,观察不同剂量FDP对急性和慢性电点燃模型的行为学和脑电发放的作用。并探讨BDNF和TrkB对电点燃及FDP抑制电点燃模型中的影响,同时,我们也观察了KCC2和NKCC1在其中的作用。第一部分电点燃模型的建立,行为、脑电及病理学观察目的：建立海马快速点燃模型和杏仁核慢性点燃模型,观察癫痫急性和慢性形成过程中大鼠的行为学和深部脑电变化；并从组织学方面研究电点燃模型的海马神经元损伤和星形胶质细胞增生的变化,探讨电点燃模型的致痫机制。方法：1.应用立体定位仪对腹侧海马和基底旁侧杏仁核进行定位,准确插入电极。测定点燃阈值后,通过每次10 sec,间隔30 min,12次／天,连续4天的阈上刺激建立大鼠海马快速点燃模型；通过每次2 sec,1次／天,连续16天的阈刺激建立大鼠杏仁核慢性点燃模型。2.根据Racine分级标准,观察癫痫行为学变化,记录癫痫发作等级、后放电阈值(afterdicharge threshold, ADT )、后放电持续时间(afterdishcharge duration,ADD)、大发作潜伏期(generalized seizure latency, GSL )、大发作持续时间(generalized seizure duration, GSD )、后放电峰值(afterdischarge peak, ADP)等指标。3.实验结束后,Nissl染色法对电极插入的部位进行确认。4. Nissl染色法观察杏仁核慢性点燃模型刺激前,刺激6次,16次后海马神经元的形态及数目的改变。5.免疫组化法观察杏仁核慢性点燃模型刺激前,刺激6次,16次后海马星形胶质细胞的形态及数目的改变。结果：1.海马快速点燃模型：随着刺激次数的增加,发作程度逐渐加重；第2天部分动物被点燃(第1次4级发作),第4天,所有动物点燃稳定引出(3次以上5级发作)；随着刺激次数增加,ADD延长,但动物被点燃后,ADD逐渐趋于稳定。2.杏仁核慢性点燃模型：随着刺激次数的增加,发作程度逐渐加重；点燃稳定引出的平均刺激次数为9.6±1.2次；刺激前ADT在100.0-250.0μA之间,而刺激第16天ADT在60.0-140.0μA之间。3.海马CA1区,CA3区和齿状回(dentategyrus, DG)神经元在刺激前后没有明显变化；星形胶质细胞在第6次刺激后就开始出现弥漫性增生、胞体增大、发出突起粗长等变化。结论：1.通过连续4天,12次／天,每次10 sec的阈上刺激,能够成功建立腹侧海马快速点燃模型。2.通过连续16天,1次／天,每次2 sec的阈刺激,能够成功建立基底旁侧杏仁核慢性点燃模型。3.在电刺激后,海马CA1, CA3和DG区没有明显的神经元缺失；但CA1和CA3区发现星形胶质细胞增生。第二部分1,6-二磷酸果糖对电点燃模型的作用目的：观察不同药物浓度FDP (0.5 g/kg和1.0 g／kg)在海马快速点燃模型和杏仁核慢性点燃模型中对颞叶癫痫形成的作用；同时,还将观察FDP对完全点燃后癫痫发作易感性的作用,以及在点燃过程中对后放电阈值的影响。方法：1.腹侧海马电极植入术后休息10天,按ADT配对将动物分为对照组、低剂量组(0.5 g/kg FDP)和高剂量组(1.0 g/kg FDP).每天刺激前1h分别穿插给药,根据Racine评分标准记录每次刺激后的癫痫发作等级,ADD, GSL, GSD,ADP等指标的变化。2.海马快速点燃模型建立后,将动物随机分为对照组、低剂量组和高剂量组。再给予5天,6次／天,与点燃模型相同参数的电刺激,每天刺激前1 h分别穿插给药。根据Racine评分标准记录每次刺激后癫痫发作等级和ADD。3.基底旁侧杏仁核电极植入术后休息10天,按ADT配对将动物分为对照组、低剂量组和高剂量组。在每天ADT测定0.5 h后,电刺激前1 h,按照组别穿插给药。记录并比较每天刺激前的ADT,根据Racine评分标准记录每次刺激后癫痫发作等级和ADD。结果：1.动物腹腔注射FDP后无腹部痉挛等异常反应。从刺激第2天起高剂量FDP显著减少海马快速点燃的每天平均发作等级,而低剂量FDP仅减少第3天的平均发作等级；高剂量FDP缩短第2天和第4天的累积ADD,而低剂量FDP对累积ADD没有显著性作用。2.高剂量组比对照组需要额外将近30%的刺激次数或者约47%的累积ADD才能到达4级；刺激第4天,高剂量组发作5级的次数是对照组的1／3；高剂量FDP显著缩短了GSD。3.高、低剂量FDP都不能减少海马完全点燃后癫痫反复发作的等级或者缩短ADD。4.随着刺激的进展,FDP不能阻止点燃引起ADT降低,但可以减缓其降低的趋势结论：1.海马快速点燃模型中,FDP能显著减少癫痫发作等级并缩短后放电,但其作用具有剂量依赖性。2.高剂量FDP能抑制癫痫点燃的形成。3.动物完全点燃以后,FDP并不能减少癫痫的反复发作和缩短反复发作后放电。4.杏仁核慢性点燃模型中,FDP能有效地抑制癫痫发作并缩短后放电,且FDP的作用同样具有剂量依赖性。随着刺激的进展,FDP并不能阻止阈值降低的趋势,但可以减缓阈值降低的过程。第三部分1,6-二磷酸果糖抑制癫痫机制的初步探讨目的：研究在海马快速点燃和杏仁核慢性点燃过程中海马BDNF和TrkB的mRNA和蛋白表达情况,并对FDP是否通过BDNF/TrkB途径起作用做初步探讨。同时,我们也观察了电刺激和FDP对海马氯离子通道KCC2与NKCC1的mRNA和蛋白表达的影响,为GABAA受体功能转化是否在FDP抑制癫痫过程中发挥作用提供理论依据。方法：1.未刺激大鼠连续1天,2天和4天腹腔注射高剂量FDP,每天注射后1h取海马组织提取RNA进行定量PCR,以GAPDH为参考,测定BDNF,TrkB,KCC2和NKCC1的基因表达情况。2.以ADT为参考,建立海马快速点燃模型。配对将动物均分为对照组和高剂量组,每天刺激前1 h,按照组别穿插给药,在刺激前、第5、24和48次刺激结束后4个时间点分别取动物的海马组织提取RNA进行定量PCR,以GAPDH为参考,测定不同时间点BDNF,TrkB,KCC2和NKCC1的基因表达的变化.3.以ADT参考,建立杏仁核慢性点燃模型。配对将动物均分为对照组、低剂量组和高剂量组。每天阈值测定0.5 h后,电刺激前1 h,按照组别穿插给药。第16天刺激结束后,分别石蜡包埋进行免疫组化实验和分离海马组织进行免疫印迹实验。观察海马BDNF,KCC2的蛋白表达的变化。结果：1.未刺激大鼠第1天腹腔注射高剂量FDP后海马BDNF mRNA表达即开始降低；而连续4天腹腔注射高剂量FDP对TrkB mRNA表达并没有显著影响。2.对比刺激前,海马BDNF mRNA表达在第5次刺激后即开始升高,一直持续到48次刺激结束；与对照组比较,高剂量FDP在刺激前和第5次刺激后均降低BDNF mRNA的表达；BDNF的特异性受体TrkB mRNA表达与刺激前比较仅在第24次刺激后显著增加,而高剂量FDP能抑制TrkB mRNA表达的增加。3.免疫组化实验发现,在杏仁核慢性点燃结束后,与对照组比较,低剂量组CA1、CA3区和DG区的BDNF蛋白表达降低,其中CA1区更为明显；高剂量组3个观察区域BDNF蛋白表达均降低。采用免疫印迹方法,我们也发现FDP能降低海马区BDNF蛋白的表达。4.未刺激大鼠连续2天注射高剂量FDP后KCC2 mRNA表达开始升高；NKCC1 mRNA在第1天和连续4天注射高剂量FDP后表达降低。5.与刺激前比较海马KCC2 mRNA在第5次刺激后开始降低,一直持续到第48次刺激结束；而高剂量FDP在第24和48次刺激后均抑制了KCC2 mRNA表达的降低。NKCC1 mRNA与刺激前相比并没有显著改变；但高剂量FDP在刺激前、第5次和第24次刺激后与对照组相比,降低NKCC1 mRNA的表达。6.脑组织石蜡切片进行KCC2和Hoechst免疫荧光双染,结果提示,KCC2主要位于神经元细胞膜上；KCC2抗体免疫组化染色结果显示,在杏仁核慢性点燃结束后,与对照组相比较,高、低剂量FDP均能增加KCC2蛋白的表达。结论：1. BDNF/TrkB途径参与电点燃癫痫的形成。2.FDP本身对BDNF的表达具有调控作用。3.细胞内氯离子失衡导致的GABAA受体兴奋性改变很可能参与了电点燃癫痫的形成。4.FDP可能通过调节GABAA受体兴奋性改变而起到抗癫痫的作用。