脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是常见的卒中亚型，发病率高居卒中第二位。脑出血发病急骤，病情往往十分凶险，发病后1月内病死率可高达50％，且幸存者多有严重的神经功能障碍。然而，脑出血后脑损伤的机理仍不够清楚，亦缺乏经严格验证有效的治疗措施。在脑出血患者中，合并脑室出血(intraventricular hemorrhage，IVH)的发生率高达50%以上，脑室出血以及继发形成的脑积水将进一步加重脑损伤，是临床脑出血患者预后不良的独立危险因素，近年来逐步受到关注。因此，脑室出血及继发性脑积水的防治研究已成为脑出血领域关注的新方向，明确IVH后脑损伤机制及探索有效的干预措施对提高临床脑出血患者的治疗效果具有重大意义。目前，脑室出血后脑损伤及继发脑积水的确切病因及机理还不是很清楚，也缺乏有效的药物治疗措施1。IVH后病理损伤机制可能包括：早期梗阻性脑积水导致颅内压增高、脑室内血肿的占位效应、血液代谢产物的毒性作用和继发慢性脑积水等2。然而，IVH后血液代谢产物与脑损伤和慢性脑积水之间的关系尚缺乏研究。近年来，血肿及其代谢产物的毒性效应作为脑出血后脑损伤的重要研究方向取得了较大进展。ICH后数日内血块开始融解，铁离子作为血红蛋白的主要降解产物过量集聚导致组织铁超载和氧化损伤，造成血脑屏障受损、脑水肿及神经元死亡等。相应的，铁螯合剂去铁敏干预措施在多种ICH动物模型研究中均被证实具有神经保护效应，因此研究ICH后铁超载相关损伤及治疗措施意义重大。脑室出血后铁代谢紊乱及其在继发脑损伤中的作用尚不清楚，我们分析IVH后溶血产物可广泛播撒至全脑室系统及蛛网膜下腔，与脑室壁及脑组织接触面更为广泛，铁超载及相关损伤可能在IVH后脑损伤及脑积水发生中同样具有重要作用。因此，我们推测：IVH后脑室内积血逐步代谢后有大量铁离子释放，可能导致显著的脑铁超载，并引起脑室壁室管膜纤毛上皮、脑室旁组织等氧化应激损伤，从而参与IVH后脑损伤及慢性脑积水的发生发展。本课题以IVH后铁超载及氧化损伤为主要切入点，观察大鼠实验性IVH后脑损伤、脑积水和铁代谢特征，并分别采用去铁敏、米诺环素和依达拉奉进行干预，观察在铁超载和氧化损伤两个关键环节的干预效应，分三部分研究验证上述推测：第一部分采用不同血液制品行大鼠单侧脑室注射建立IVH损伤模型，明确IVH后脑损伤、脑积水和铁代谢相关特征，观察铁螯合剂去铁敏干预是否能减轻IVH后脑损伤；第二部分采用脑室内铁离子注射模型，观察铁离子在脑室内的直接脑损伤效应，以及米诺环素对脑室内铁损伤的保护效应，进一步证明铁离子可能参与了IVH后继发损伤及脑积水形成；第三部分采用实验性大鼠IVH模型，观察自由基清除剂依达拉奉对IVH后氧化应激损伤及脑积水的干预效应，验证氧化损伤参与IVH后室管膜损伤及脑积水发生的推测。一、铁离子在大鼠实验性脑室出血后脑损伤中作用及去铁敏的干预研究目的通过侧脑室注射自体全血、抗凝血或红细胞建立大鼠脑室出血模型，动态观察出血后脑损伤、脑积水、脑铁沉积和铁代谢相关蛋白表达变化，以及铁螯合剂去铁敏的干预效应，从而评估铁离子超载在脑室出血后脑损伤中的作用及铁螯合治疗的意义。方法实验分为3部分，第一部分将实验动物分成生理盐水对照组(Saline)、自体血组(Bloodor IVH)及抗凝血组(Heparinied blood)，分别将200μl生理盐水、自体血及自体抗凝血注入大鼠右侧脑室，分别于1天、3天、7天、14天和28天行MRI扫描，并于上述时象点留取脑标本行组织学、免疫组化和Western blot检测；第二部分实验观察红细胞脑室内注射的效应，将动物分为浓缩红细胞组(Packed RBC)和融解红细胞组(Lysed RBC)，分别将50μl浓缩红细胞和融解红细胞注入大鼠右侧脑室，于24小时行MRI扫描并留取标本供组织学检测；第三部分观察去铁敏的干预效应，实验动物分为去铁敏干预组(IVH+DFX)和溶剂干预组(IVH+Veh)，分别给予右侧脑室内注入200μl自体全血，再于血液注射后2小时、6小时分别给予去铁敏(DFX，100mg/kg)或溶剂，肌肉注射，然后每12小时注射一次，共7天疗程。所有动物分别于1天、3天、7天、14天和28天行MRI扫描，扫描结束后留取标本行组织学检查。结果1.单侧脑室注血法成功建立大鼠实验性IVH模型，自体血及自体抗凝血注射均导致明显脑积水，至28天脑室仍显著扩张，但抗凝血组脑积水轻于非抗凝血组；IVH引起大鼠脑铁蓄积和HO-1、Ferritin表达升高，以及后期海马萎缩、海马神经元缺失和脑室壁胶质增生。2.脑室内注射融解红细胞导致急性脑室扩张、脑水肿，明显重于浓缩红细胞组，脑组织HO-1及OX-42免疫阳性反应均强于浓缩红细胞组。3.去铁敏可减轻IVH后脑室扩张和铁蓄积，Ferritin表达水平也相应降低，去铁敏干预组于IVH后28天海马萎缩、海马神经元缺失均较溶剂对照组减轻。结论大鼠IVH导致持续脑室扩张，并伴有明显的脑铁蓄积和铁代谢相关蛋白表达上调，相应地给予铁螯合剂去铁敏治疗可减轻IVH后脑积水、海马损伤及铁蓄积，提示铁超载可能是IVH后脑损伤和脑积水的重要机制，去铁敏在IVH后继发脑损伤治疗中具有的应用前景。二、大鼠脑室内铁离子注射模型脑损伤及米诺环素的干预研究目的建立大鼠脑室内铁离子注射模型，观察铁离子脑室内注射后的直接脑损伤效应，探讨米诺环素和巨噬细胞/小胶质细胞抑制剂(macrophage/microglial inhibitory factor，MIF)对在体条件下脑室内高铁所致脑损伤的保护效应及机制。方法将实验动物分成生理盐水对照组(Saline)、氯化亚铁组(FeCl2)、氯化亚铁+米诺环素组(FeCl2+Minocycline)、氯化亚铁+MIF组(FeCl2+MIF)、三氯化铁组(FeCl3)和三氯化铁+米诺环素组(FeCl3+Minocycline)，各组分别将上述(混合)溶液200μl注入大鼠右侧脑室内，氯化亚铁和三氯化铁浓度为0.5mM，米诺环素和MIF浓度为1.5mM；模型建立后1天分别行MRI扫描、脑水含量测定，留取致伤后1天组织标本行Fluoro-Jade C、PANT和TUNEL检测；分别采用铁三嗪比色法和改良铬天青S法检测米诺环素对二价和三价铁离子的螯合力。结果1.氯化亚铁脑室内注入引起急性脑室扩张、脑水肿和神经元变性损伤，米诺环素和MIF可明显抑制氯化亚铁脑室注射后所引起的小胶质细胞活化，但仅有米诺环素能显著降低大鼠死亡率，减轻脑水肿和神经元损伤。2.三氯化铁脑室内注射引起显著的急性脑室扩张和海马神经元变性，米诺环素能减轻神经元损伤，但未减轻脑室扩张。3.米诺环素对二价和三价铁离子均具有螯合效应。结论铁离子脑室内注射可导致急性脑积水、脑水肿及神经元损伤；米诺环素具有亚铁和三价离子螯合力，并能显著减轻铁离子脑室内注射所致的脑水肿和神经元损伤，其神经保护作用的机理可能与铁螯合效力有关。关键词：脑室出血铁米诺环素脑积水三、依达拉奉对大鼠脑室出血后脑损伤的干预研究目的观察自由基清除剂依达拉奉对实验性大鼠脑室出血后氧化应激损伤、脑积水和神经行为学损伤的干预效应。方法研究分为2部分，第一部分为急性期指标测定，动物分为生理盐水对照组(Saline)、脑室出血+依达拉奉干预组(IVH+Edv)和脑室出血+溶剂干预组(IVH+Veh)，分别给予右侧脑室内注入200μl生理盐水或不抗凝自体全血，注血后分别给予依达拉奉(6mg/kg，IVH+Edv组)或溶剂(IVH+Veh)皮下注射，损伤后24小时取脑组织检测脑含水量、丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性。第二部分实验分组同前，注血组大鼠分别给予依达拉奉(6mg/kg，IVH+Edv组)或溶剂(IVH+Veh)皮下注射共3天(注血后15分钟，1天和2天)，IVH后23天开始行为学检测，28天行MRI扫描并留取标本行组织学检查。结果：1.大鼠IVH模型可导致急性脑水肿、氧化应激及后期学习记忆功能缺陷。2.依达拉奉减轻了IVH后组织氧化应激、脑水肿及脑室壁室管膜纤毛上皮损伤，改善了大鼠后期脑积水和学习记忆功能缺陷。结论自由基清除剂依达拉奉可减轻大鼠IVH后氧化应激和急性脑水肿，并改善后期脑室壁损伤、脑积水和学习记忆功能缺陷，氧化应激可能是IVH后脑损伤及脑积水的重要机制和治疗靶点之一。