DC在病毒、细菌、寄生虫等病原体感染的过程中发挥极其重要的作用，在肿瘤、免疫性疾病的基因治疗方面也有可喜的应用前景。由于DC在机体内的含量很少，因此体外大量培养和扩增DC是研究其功能、阐述某些感染性疾病的发病机制和用于治疗目的的基础。外周血单核细胞是DC的前体细胞之一，从外周血单核细胞体外诱导扩增DC，取材方便、并可反复取材，细胞表型均一，有很好的应用价值。本研究拟建立从人外周血单核细胞诱导扩增大量DC的简便方法并进行表型鉴定，从而为今后开展疾病发病机制、 内科学（传染病）浙江大学博士学位论文 治疗和预防错施等方面的研究打下基础。 1．材料与方法 本研究采用文献推荐的GMAISF联合几一刺激单核细胞，体外大量扩 增DC的方法，并加以简化。步骤入下：①取健康成人白细胞成分血，分离 单个核细胞，调整细胞数为ZX10’细胞巾讯后用贴壁法纯化外周血单核细胞： ②用含rhGM＊SFQ ＊ rhIL－4Q0n帅）的RPMI 1640培养基， 37C 5％COZ培养单核细胞；第 3天半量换液，第 6天收集细胞（以下简称 DC6）；＠用相差显微镜和透射电镜进行形态学分析，计算 DC6细胞得率， 流式细胞仪分析 DC6表型；④以 INF a D0咖L）刺激DC6共 48小时， 进行流式细胞仪分析，同时设阴性对照。 2．结 果 门）形态学分析：用相差显微镜观察细胞的生长过程，可见①在均匀 贴壁的圆形细胞的单核细胞中加入30n g／mLg／mL hGMcSF和20n lir1Llir1L rhIL4， 数小时后细胞开始聚集，并逐渐形成大量细胞聚集体；②培养第3天，有大 量疏松粘附的增殖性细胞集落，并开始产生悬浮或疏松贴壁的形态不规则的 细胞；③培养第6天，有大量的悬浮细胞和少量疏松粘附的细胞团，细胞形 态极不规则，均有大量的胞浆突起，呈“树突样”或“毛刺样”。透射电镜．观察DC6，可见细胞伸展出大量的胞浆突起，细胞核不规则，胞浆内有大 量的滑面、粗面内质网和高尔基体，并可见Birbec样颗粒，线粒体少见。 （2）DC6细胞表型流式细胞仪分析 根据FS／SS设门，结果提示 DC6的均质性好（图l－3A）。DC6的表型特点为CDla＋、CDSDe、CD86＋、 CD83一、CD14＋（但较单核细胞表达水平下降，单核细胞的MnX为12．l）、 CD56．、CD3．、CD19。3次重复实验结果类似。且CDla＋细胞比例分别为 98．5o、98．8o、99．8o，提示本方法所获得的DC6纯度高。 5 内科学（传染病）浙江大学博士学位论文 D）DC6得率 根据公式DC6得率一 昙钱绘刘％，3次细胞 ”“”““”IHrtpe ’I“ytl“““”’Hrt－ ＄N＄ft－“””””’“”“”““ 培养细胞得率分别为66．2％、57．3％和62．2％；平均为61．9％。 N）IN’－－－－ a对细胞表型的影响 INFa臼0ng／mL）刺激 DC6共 48 ，J’时，重复3次实验，结果显示DC表达CD80、CD86以及CD83有不同， 程度的增加。 3．讨 论 门）外周血单核细胞体外诱生DC 本研究采用白细胞成分血，通 过贴壁法纯化单核细胞；避免了全血的浪费，大大降低了使用磁珠分离技术 的高昂费用；而且本实验方法所得 DC6的得率平均为 61．9％（66．2％、57．3％、 62．2％），与文献报道相似。且DC6具有典型的外周血单核细胞来源的DC 的生长特点和形态学特征。 （2）本研究中DC6的表型特征为CDla＋、CD80＋、CD86＋、CD3一、 CD19一、CD56－；与文献报道一致。而CDla＋细胞比例非常高（98．5％，98．8％， 97．5％）；提示DC6的纯度高，明显优于国内文献报道。 （3）结果还显示IN’－－a可促进36表达CD83、CD80、CD86，由于 CD83是成熟DC的特征性标志，CD80、CD86参与了DC的淋巴细胞激活 功能，因而提示l’n7a可促使co成熟。“4．结 论 采用本文的方法成功地从外周血单核细胞中体外诱导扩增DC，所得的 细胞具有典型的co形态学特征，并经细胞表型鉴定证实为nc；细胞得率 达到61．9％左右，可为进一步实验研究提供足量的细胞。本研究结果也同样 证明了 INI7 a能促使未成熟 DC的成熟。 6 内科学（传染病）浙江大学博士学位论文