白酒 窖泥中细菌微包埋培养的研究

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浓香型白酒发酵过程中,窖泥微生物是核心,而窖泥中90%以上的微生物为未培养微生物,如何获得这些微生物资源成为白酒行业发展的关键。近几年,一些新的培养方法不断出现,如稀释培养法、扩散盒培养法、模仿微生物生境培养和微生物包埋培养法等。其中,微生物包埋培养法能够从某种程度上模拟微生物生境,延长培养时间,使样品中的微生物处于连续开放的培养环境中,而将单个微生物包埋培养,避免了共培养时营养竞争问题,同时又不破坏微生物之间复杂的生态关系,使样品中大量微生物获得纯培养,因此采用此方法可培养出以往未被培养的窖泥微生物,对白酒发酵的研究有着重要的意义。根据生态学原理,采用五点法对黑龙江富裕老窖酒业有限公司的优质窖泥进行取样。通过搅拌乳化法对白酒窖泥中细菌进行微包埋,首先对微球制备的主要影响因素:琼脂糖的浓度、设备的转速和司盘80浓度进行正交优化,然后对微球的稳定性、通透性、p H的影响进行了研究,在此条件下对包埋率进行了测定,选择窖泥浸出液作为培养基,模拟微生物生境进行包埋培养,并利用流式细胞仪对含克隆子的微球进行分选。以通过传统分离培养得到的梭状芽孢杆菌作为对照菌株,筛选出生长缓慢的窖泥微包埋菌株,并通过气相色谱分析菌株发酵液的主要成分,进一步筛选出白酒发酵过程中的功能菌株作为研究对象。对筛选出的菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,并采用响应面分析法优化其生长条件。微球制备的主要影响因素优化结果为:琼脂糖浓度3%(w/v),设备转速1800rpm,司盘80浓度1%,所制备微球平均粒径为178.52μm,跨度(span)为0.43微球呈单分散,此时微球具有良好的稳定性和通透性以及能够适应各种p H条件,包埋率可达36.7%,通过微生物包埋培养并经流式细胞仪分选分离出95株细菌,利用菌体生长试验与色谱分析相结合筛选出4株生长较为缓慢且产生白酒风味物质较高的菌株LS4、LS64、LS66、LS85,经鉴定LS4为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ML233),LS64、LS85为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),LS66为Uncultured bacterium clone N8-7。鉴于LS66产白酒风味物质较多,而且为一株未培养菌株,所以对菌株LS66的培养条件进行响应面优化,确定培养基中乙醇、乙酸钠和窖泥浸出液的添加量为主要影响因素,其添加量分别为1.52 m L/100m L,0.59 g/100m L,10.23 m L/100m L,优化后菌体浓度(42.67±0.895)×10~6cfu/m L,比优化前增加了11%左右。
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