心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)已成为人类死亡的重要原因之一,且发病率逐年上升,严重威胁着人类健康。而当前心肌梗死的标准疗法主要是依靠药物溶栓、内科介入术和外科冠脉搭桥术来重建血运,从而挽救濒临死亡的心肌细胞,但是,这种代偿性的治疗并不能从根本上逆转已死亡的心肌细胞,而且几乎不能再生心肌,因此许多患者发生心肌重构最终因心力衰竭而死。近十几年来,随着干细胞疗法研究不断深入,逐渐掀起了一阵干细胞向心肌细胞系转化再生的热潮,包括多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSC)(像胚胎干细胞、诱导性多能干细胞等),成体干细胞(Adult stem cells,ASC)(如骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等),心脏干细胞(Cardiac Progenitor Cells,CPCs)或非心脏来源的(来源与其它组织器官)干细胞等,都被报道证实了有向心肌细胞或血管细胞转化的潜能。然而,就在千细胞向心肌转化的基础研究频获捷报的时候,干细胞的临床应用却处处遇到瓶颈,干细胞移植存活率不足、细胞移植后患者长期心功能未见明显改善等信息使得移植之路步履艰难。在过去的研究中,大多是运用病毒或脂质体来携带基因的方法来直接诱导或是重编程从而提高种子干细胞的形成率、移植率和存活率,但是由于病毒使用所带来的免疫排斥问题和基因突变引起的致癌风险,都极大地限制了在临床中的应用。而近期大力推行的小分子化合物重编程法即使在一定程度上消除了安全方面的顾虑,却由于其过度依赖信号转导通路及细胞状态而出现重编程效率低,重复性差等局面。因此,怎样才能使用安全面高效的方法来获得适用于心肌修复与再生治疗的临床级别的干细胞,现已成为干细胞转化研究的重要难题。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是由中胚层分化而来的一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。它属于非均质细胞群,转录组十分复杂,在不同发育途径和生理过程中可以编码众多蛋白质,并且由于它具备低免疫原性,因此在临床应用中备受青睐。然而,目前BMSCs的报道却大多数只针对它的旁分泌功能从而提高心肌梗死后的心功能,对于其直接定向分化为心肌细胞的能力一直备受争议,因此直接移植BMSCs必然使其功能无法充分发挥。而心脏干细胞则是一类心脏组织的特异性干细胞,除了具备普通千细胞的基本特性之外,还拥有直接分化为心脏三个谱系(心肌细胞、血管内皮细胞和心脏平滑肌细胞)细胞的能力,是心肌内一个非常好的直接“干性”能源。我们知道,心脏的发育是受心肌关键转录因子调控网络控制的,2012年Nature杂志中有报道,心肌关键转录因子Tbx5、Hand2、Mef2c和Gata4的联合能够促进向心肌细胞系进行重编程,若是心脏关键转录因子的缺失和表达异常则会出现心肌发育困难的现象,甚至不能分化为完整心肌,由此可见,这个调控网络是将上游的诱导信号与下游的调控基因联系起来,从而控制心肌细胞系的发育与分化。研究人员也多次尝试转染这四种心肌特异转录因子功能基因,试图诱导BMSCs向心肌细胞系转化,最终都因为BMSCs复杂而强大的转录组而无法从根本上改变此干细胞的特性。鉴于此,本实验室则从蛋白质着手,自行研发并成功构建了一种能够传递蛋白质的纳米载体—NG试剂,它能够快速耦合蛋白质分子逐渐形成纳米-蛋白复合体,高效通过核膜与质膜屏障,克服干细胞内溶酶体、蛋白酶等对外源性蛋白质的降解,最后释放出蛋白从而发挥生物学效应。本研究使用人骨髓来源的间充质干细胞为细胞来源,首先探索出纳米-蛋白复合体的最佳构建条件极其影响因素;并通过检测转染后胞内4种心肌转录因子蛋白的表达水平分析复合体对BMSCs的转染效能以及细胞毒性;其次则初步探索了纳米-蛋白质复合体的基本入胞过程和蛋白质的胞内代谢;最后运用蛋白重编程技术,于诱导后检测CPC标志物和相关表达产物,着重研究蛋白诱导BMSCs重编程生成心脏祖细胞(protein induced Cardiac Progenitor Cells,piCPCs)的整体过程和分化效能。研究方法1.构建不同摩尔数配比的PEI(聚乙酰亚胺,1200KD)-DNaseI(DNA酶I,大小为 14KD)、NG5000-DNase Ⅰ(5000 为 NG 粒子分子量)、NGlarge-DNaseI复合体(large代表分子量较大且参差不齐,平均值约为30000),以PEI为阳性对照,利用激光散射仪分别检测其粒径大小和Zeta电位值,筛选出合适的配比组,并于透射电镜下观察复合体的原始外貌。同时,将上述3种复合体与适量的质粒DNA耦合,于琼脂糖凝胶电泳中观察DNA条带的变化从而验证纳米粒子对蛋白质(DNaseI)的保护作用;除此之外,我们还成功构建了 PEI-BSA、NG5000-BSA、NGlarge-BSA复合体,于SDS-PAGE电泳下观察BSA(分子量为66KD)条带变化,重复验证复合体是否构建成功及载体的稳定保护作用。接着,将不同摩尔数配比的NG-GFP复合体导入hBMSCs内,通过免疫荧光染色和WestenBlot检测胞内GFP的表达量来反应其转染效能。2.经过比较,深入探索NG纳米-蛋白质复合体的转染潜能,并摸索复合体构建的影响因素,分析在不同浓度的pH值,血清,添加剂下转入胞内蛋白的荧光表达情况;当条件稳定时,则转染不同种类的蛋白质(绿色荧光蛋白GFP、(β-半乳糖苷酶、Tbx5、Hand2、Mef2c和Gata4四种转录因子)依次进入不同种类的细胞(人骨髓间充质干细胞、人皮肤成纤维细胞、人乳腺癌细胞、人脐带内皮细胞)。再次运用上述三种纳米粒子包裹GFP-N质粒DNA从而构建纳米-DNA复合体,接着对BMSCs进行转染,以lipo2000为阳性对照,3d后荧光显微镜下观察质粒DNA荧光表达情况,比较基因载体与蛋白质载体的转导效能。3.利用上述成功构建的NG5000-GFP复合体转染BMSCs,8h后用ER-TRACKERDYES进行活细胞内质网染色,接着用Hochest33324核染,可观察转入胞内的GFP蛋白与细胞器内质网的荧光定位情况,初步探索纳米-蛋白复合体的基本入胞过程,同时也能够反应出GFP(胞浆蛋白)转染后的胞浆定位情况。待 NG5000-Hand2 复合体入胞后,于 1h、4h、8h、16h、24h、48h、72h和96h四个时间点在confocol下观察蛋白荧光的入胞增强程度和衰减程度,从而揭示Hand2蛋白入胞的短期时效性及在核内的长期代谢时间。最后,应用lipo2000脂质体、Pro-Ject商品化蛋白转染试剂和NG三种载体分别与Hand2蛋白构建复合体转染BMSCs,在红外荧光检测仪下观察荧光强度大小从而判断三者转染效率的高低。另外,继续深入研究PEI、NG5000和NGlarge这三种纳米粒子对BMSCs的长短期毒性以及三者与Hand2蛋白耦合形成的复合体对BMSCs的凋亡作用影响,前者运用MTT法分别以1d、3d、5d、7d和9d进行检测,后者则在3d时收取细胞样本做AnnexinV-PI流式检测。4.以hBMSCs为研究对象,依靠成功构建的NG5000-Tbx5、Hand2、Mef2c、Gata4四种复合体为重编程工具,并在chir99021、IWR-1和小分子化学物质,bFGF、VEGF和IGF-1等生长因子的辅助下,诱导细胞向心脏祖细胞分化。分别于诱导后1d、3d、8d和15d观察hBMSCs的形态学变化,提取细胞总RNA行Q-PCR检测心脏祖细胞标志及其所分化细胞的mRNA的表达情况,同时通过免疫荧光(IF)和蛋白印迹法(Wb)做piCPCs蛋白表达方面的相关检测。研究结果1.在激光散射粒径仪下观察到,当PEI或NG粒子与DNase I的摩尔数配比在合适的范围内时,它们形成的复合体曲线会呈现单峰状态,且粒径能够稳定在200-500nm(PEI)和100-300nm(NG)之内,此时透射电镜结果也显示了复合体致密而紧实的球状结构,呈均匀分布状,同时Zeta电位为正,绝对值较高,复合体体系稳定;而当二者配比不恰当时(载体个数相对过多或蛋白个数相对过多),其复合体的构建就出现障碍,曲线峰值水平与DNase I对照组相似,约在5nm以下,Zeta电位呈强正极性或是逐渐向负极移动,绝对值变小逐渐趋向于DNase Ⅰ对照组的负极性。接着应用酶与底物相互作用原理,在琼脂糖凝胶电泳中使酶蛋白DNase Ⅰ在载体的修饰后无法作用于质粒DNA,SDS-PAGE电泳中载体与底物蛋白BSA的耦合后也使BSA在一定程度上抑制了蛋白酶K的降解。同时,在免疫荧光染色结果显示当NG-GFP复合体的摩尔数配比在1:1时的转染效果最好,Westen Blot实验也精确地检测到1:1时胞内GFP的表达量最高。除此之外,我们还对pH值,转染时血清浓度,添加剂PEG这些影响因素进行分析,结果显示,当构建体系中pH值为7.0、终浓度为25μg/mL的PEG可以对蛋白质的运载更有利,而条件中血清浓度的选择并不影响整个过程。因此,在合适的转染条件下,我们分别成功将GFP、B-半乳糖苷酶、Hand2、Gata4四种蛋白各自依次转入至人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)、人皮肤成纤维细胞(hFF)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人脐带内皮细胞(hUVEC)四种细胞中,而且转入的蛋白仍然具有活性。最后,在与基因载体的比较中发现,PEI(1200KD)和NG粒子基本不具备基因运载能力。2.利用NG试剂运载GFP进入hBMSCs,其在细胞内的绿色荧光分布以胞浆为主,并且与内质网的位置几乎是重叠的;在NG转染Hand2的试验中,1h后便可看到蛋白穿膜入胞,随着转染时间的延长,Hand2的表达量也逐渐上升,于24h时达到顶峰状态,同时具有靶向入核的能力,48h后蛋白代谢加剧,在96h时转入的Hand2几乎消失不见。说明NG试剂转染蛋白进入细胞后的分布与被转染蛋白质的特性有关。通过比较Liposome 2000、Pro-Ject试剂和NG试剂三者运载Hand2蛋白的能力,发现Pro-Ject的效能优于NG,NG又优于Liposome 2000,但在光镜下可见Liposome 2000和Pro-Ject试剂对细胞造成了明显的伤害。因此,我们用MTT法和AnnexinV-PI凋亡测试对蛋白载体以及蛋白复合体做了全面的毒性检测,结果可见,PEI不论在长时间还是短时间效应上其对细胞的毒性都要明显大于NG粒子,且NG长时间作用于细胞后其毒性并没有持续加重反而相对有所缓解,而凋亡实验中发现小分子量的NG粒子(NG5000)耦合蛋白质形成的复合体对细胞的损害最轻,故小分子的NG粒子在蛋白转染方面更加优于大分子量的NG。3.Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5四种转录因子能够在NG的修饰包装后几乎完全靶向导入hBMSCs细胞核。hBMSCs向心脏祖细胞分化的过程需要大约在15d以上,在第5d时细胞就初具变化,8d时开始形成团聚克隆状细胞团,待至15d时克隆状态更加明显,细胞拉长团块之间逐渐形成缝隙而分开。Q-PCR结果显示,Tbx5、Nkx2.5(心肌祖细胞特异标志)、Oct4(多能干细胞标记)等的mRNA表达水平在诱导第8-15d时都有一定水平的提高,但是每个基因表达出现的峰值时间不一。细胞蛋白表达水平方面可见心脏祖细胞所包含的三个心肌谱系的标志:内皮细胞系(如CD31)、心肌细胞系(如Nkx2.5)和平滑肌细胞系(sm-MHC和α-SMA)在诱导后第15d时皆有表达,每种蛋白的表达时序和变化也不尽相同。研究结论1.成功将DNA酶I(DNaseI/14KD)、牛血清白蛋白(BSA/66KD)、绿色荧光蛋白(GFP/28KD)、β-半乳糖苷酶以及 GHMT(Gata4/44KD、Hand2/23KD、Mef2c/54KD和Tbx5/35KD)四种心肌特异转录因子与NG试剂耦合构建形成纳米-蛋白复合体(蛋白分子量从14KD至116KD);并从粒径及Zeta电位分析得到其基本特性;两种电泳结果显示NG粒子具有很好的蛋白保护功能,它与上述几种蛋白质分子的最佳摩尔数配比为1:1,而PEI与蛋白的则是4:1。2.分别成功地将GFP、B-半乳糖苷酶、Hand2、Gata4四种目的蛋白(既包括胞浆蛋白也包括核蛋白)各自依次导入hBMSCs、hFF、MCF-7和hUVEC四种受体细胞中(涵盖体细胞、干细胞和肿瘤细胞),其最佳pH值约7.0,转染时的血清浓度对蛋白质的转染基本无影响。3.NG-蛋白复合体穿膜极快,以Hand2蛋白为例,1h即有蛋白转入的现象,且在胞内的整个代谢时长大约为48h。另外我们发现,Pro-ject(商品化蛋白转染试剂盒)效率明显高于Lipo 2000,并略高于NG试剂(但无显著性差异);三者经过比较之后发现,Pro-ject和Lipo2000对细胞的毒性作用较为明显,而NG对细胞的长时间蓄积毒性作用则较弱,尤其是小分子NG粒子与蛋白形成的复合体,在适宜浓度下入胞几乎不导致细胞发生凋亡作用。4.GHMT经过NG修饰包装后,联合一些辅助细胞因子、小分子化合物等,来重编程诱导hBMSCs,8d后细胞即可呈现细胞克隆团的初态,至15d或更长时间之后形成了心脏祖细胞,它所包含的三个心肌谱系细胞的mRNA及蛋白表达水平显著增高,且细胞更具多能性。因此,NG试剂是一个优良的细胞重编程纳米试剂,能特异性转导蛋白入核,较传统的病毒(或质粒)转染技术具有无可比拟的优势。