丰城鸡血藤(Millettia Nitida Benth.var.Hirsutissima Z.Wei)是我国南方地区使用的一味传统中药材,药用部位是干燥藤茎。主要产自江西、福建、广东、广西和湖南。在临床上具有活血、补血、通络,主治肢体麻木、瘫痪、腰膝酸痛、月经不调、瘫痪的功效,丰城鸡血藤中主要以黄酮类成分发挥其生物活性作用,有抗炎及免疫调节等多种药理作用。在漫长的用药历史中,虽然丰城鸡血藤的有效性及可靠性得到了充分的验证,但现代研究非常匮乏。为推进该品种的现代化发展,获取新型抗类风湿性关节炎有效药物,对丰城鸡血藤抗类风湿性关节炎物质基础及活性成分的研究非常必要。目的采用液质联用技术对丰城鸡血藤二氯甲烷提取物中化学成分的鉴定,考察该部位的体内抗类风湿性关节炎药效学作用,阐明丰城鸡血藤抗类风湿性关节炎作用的物质基础和抗炎作用机制。应用体外细胞模型,考量丰城鸡血藤二氯甲烷部位和7个单体化合物对人类风湿性关节炎滑膜细胞的增殖影响。方法1.采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法,对丰城鸡血藤二氯甲烷提取物中化学成分进行鉴定,明确该部位中的主要化学组成。2.体内实验:建立牛Ⅱ型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型,将60只SD大鼠随机分为6组,空白组、模型组、甲氨蝶呤组、丰城鸡血藤二氯甲烷高剂量(220mg/kg),丰城鸡血藤二氯甲烷中剂量组(110mg/kg),丰城鸡血藤二氯甲烷低剂量(55mg/kg),丰城鸡血藤给药组连续灌胃35天。甲氨蝶呤组剂量为1mg/kg,每周灌胃一次,模型对照组、正常对照组不给予特殊药物处理。在治疗过程中每周对所有大鼠进行活动状态、AI指数、体重改变及足趾肿胀进行观察,并记录。给药结束后,各组大鼠腹主动脉取血,收集好血清,称重大鼠的胸腺和脾脏,于4%多聚甲醛中固定大鼠后肢踝关节和肝脏组织。用ELISA法测定各组大鼠血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的含量,并进行大鼠关节及肝脏病理切片观察。3.体外实验:研究从丰城鸡血藤中分离得到的部分化合物对人类风湿性关节炎滑膜细胞(RA-FLS)的增殖作用,用不同浓度的7个单体化合物、丰城鸡血藤二氯甲烷部位提取物和甲氨蝶呤分别作用于体外培养的RA-FLS细胞,采用CCK-8比色法检测该细胞增殖的情况,进行抗类风湿性关节炎的活性评价。结果1.本研究采用UPLC-Q-TOF-MS-MS法,根据化合物精确分子量、计算分子式,结合二级质谱数据,参照对照品的质谱裂解规律,在参考文献的指导下,从丰城鸡血藤二氯甲烷提取物中鉴定出34个化合物,其中26个黄酮类化合物,有机酸类化合物3个,香豆素类化合物1个,蒽醌类化合物2个,三萜类化合物1个,甾体类化合物1个。2.牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂造模的CIA大鼠,在加强免疫后第3天开始出现关节红肿,观察AI指数评分、足趾肿胀,空白组与模型组相比较,有统计学差异,说明模型建立成功。3.在CIA大鼠发病过程中,促炎因子的表达明显升高,模型组大鼠血清中的促炎因子IL-1β、TNF-α的分泌明显高于空白组(P<0.01),丰城鸡血藤二氯甲烷提取物能下调IL-1β,TNF-α的分泌,其中220mg/kg对IL-1β,TNF-α的抑制作用与M TX相当,而低剂量虽能降低炎性因子的表达,但无显著差异。4.丰城鸡血藤二氯甲烷提取物对CIA大鼠病情有治疗作用,明显抑制大鼠足趾肿胀,减少关节滑膜炎性浸润及纤维增生等炎症反应,并能在一定程度上恢复其免疫能力,是潜在的抗风湿有效部位,CIA模型大鼠的肝脏病理与正常大鼠无明显异常。5.对丰城鸡血藤中分离得到的部分单体化合物(刺芒柄花素、染料木素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、印度黄檀苷、大豆黄素、表羽扇豆醇)和丰城鸡血藤二氯甲烷部位进行抗类风湿性关节炎活性筛选测试结果显示:阳性对照组细胞增值率均小于空白组且差异具有统计学意义(P<0.01),证明甲氨蝶呤作为阳性对照药物符合本实验。除表羽扇豆醇化合物外,其余均在一定程度上对RA-FLS细胞的增殖具有抑制作用(P<0.05或P<0.01)。其中,丰城鸡血藤二氯甲烷提取物、刺芒柄花素、染料木素、芒柄花苷的IC50值较小,对滑膜细胞增殖有显著的抑制效果,提示具有较好的抗RA活性。而大豆黄素、毛蕊异黄酮、印度黄檀苷三个化合物的IC50值在最大给药浓度以上。染料木素在本实验设定给药浓度范围内,对滑膜细胞增殖的抑制效果随给药浓度的增加而提升,具有一定的剂量依赖性。在单体化合物中染料木素的抗RA效果最为理想(具有较高的细胞增殖抑制效果和较低的IC50值)。结论丰城鸡血藤二氯甲烷部位具有较好的体内抗类风湿关节炎作用,是通过抑制CIA大鼠血清中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达来发挥其作用,是一个有潜力的抗类风湿性关节炎候选药物。丰城鸡血藤中抑制RA-FLS细胞增殖的有效成分是黄酮类化合物,主要是刺芒柄花素、染料木素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、印度黄檀苷、大豆黄素等活性成分发挥作用。