RhoA在妊娠期糖尿病胎盘滋养层细胞胰岛素抵抗中的作用机制研究

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研究背景和目的:妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期间首次发现或发生的糖耐量异常,尽管大部分GDM在产后均能恢复正常,但其短期或长期的不良代谢结局对母婴均产生深远影响。越来越多的证据表明,GDM的发病机理与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)相同,包括胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和进行性β细胞功能障碍。怀孕是一段独特的代谢可塑性过程,适当的胰岛素抵抗是生理性的优先适应胎儿生长所必需,母体胰岛素分泌能力随之增强维持代谢健康的妊娠所需,这有助于控制葡萄糖从母亲到胎儿的运输,从而保障胎儿正常生长发育。孕中期由于胎盘激素的产生(孕酮、雌激素、催乳素等)导致胰岛素抵抗的发生,但是,严重的孕妇胰岛素抵抗会导致高血糖症。GDM中母体系统发生的变化,如脂毒性,炎症和氧化应激,以及脂肪因子信号传导的损伤均与β细胞适应受损有关。但妊娠期间,除肝脏、脂肪、肌肉等外周组织外,胎盘也是胰岛素的一个效应器官,由于胎盘与胰岛β细胞间存在交互作用,妊娠时不仅外周组织存在胰岛素抵抗,胎盘在母体胰岛素抵抗中也起重要作用,考虑到大多数异常的葡萄糖代谢和胰岛素抵抗通常在孕妇产后恢复正常,我们推断胎盘在GDM发生过程中发挥重要作用。RhoA(RAS同源性-A),Rho亚家族成员,RhoA在与GDP结合的非活动状态和与GTP结合的活动状态之间的循环,发挥分子开关的作用,调节细胞表面受体和不同的细胞内信号蛋白。Rho激酶(ROCK),是RhoA的下游效应器,既往研究发现RhoA/ROCK在T2DM IR的过程中起着至关重要的作用,RhoA/ROCK信号通路是非常重要的转导系统,主要涉及细胞生长,分化,迁移及发育。先前的研究报道RhoA/ROCK通路作用于细胞骨架或靶蛋白后,诱发肌动蛋白细胞骨架重组、调控基因转录和细胞周期等。此外,慢性组织炎症也影响胰岛素信号传导并导致IR。一系列的研究表明RhoA参与糖尿病及其并发症的发生,并且通过NF-κB信号传导途径调节炎症反应,从而影响糖尿病并发症的走向。基于以上研究结果,RhoA在妊娠妇女胎盘中发生的变化及作用引起了我们的关注。我们应用蛋白组学方法检测GDM及正常妊娠孕妇胎盘,发现RhoA在GDM组有变化趋势,通过扩大样本量,用Western Blot方法验证RhoA在GDM组确有显著升高。因此,我们推断RhoA/ROCK信号通路可能在胎盘组织也参与了GDM的发病过程。本研究主要探讨在GDM的发生过程中,RhoA/ROCK通路如何调节胎盘滋养层细胞的变化,及其与GDM发生的因果关系,为GDM的发生机制提供理论依据并对GDM的治疗提供新的靶点。研究方法:1.采用Western Blot方法检测25名GDM孕妇和25名正常糖耐量孕妇胎盘RhoA蛋白表达水平,ELISA方法检测血清学RhoA水平并收集血糖、孕周等相关信息,通过SPSS16.0软件对RhoA与相关变量进行Spearman相关分析。2.采用C57BL/6J雌性小鼠通过高脂饮食建立GDM动物模型,检测孕鼠体重、葡萄糖耐量、空腹胰岛素值并计算胰岛素抵抗指数;采用Western blot检测小鼠胎盘组织RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白及胰岛素信号通路相关蛋白,葡萄糖转运子GLUT4和GLUT1表达水平。3.构建胰岛素抵抗HTR8-SVneo细胞系。利用不同胰岛素浓度的培养基培养HTR8-SVneo细胞株,分别在24 h,36h,48 h,60 h葡萄糖-己糖激酶的方法检测培养基葡萄糖消耗量。确定建立胰岛素抵抗的最佳浓度和时间,Western Blot检测RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表达情况、检测胰岛素信号通路和NF-κB炎症通路相关蛋白,细胞增殖及凋亡相关蛋白表达情况,通过CCK8的方法检测细胞增殖,Hoechst染色评估细胞凋亡,Real-time PCR检测细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平变化情况。4.通过fasudil抑制RhoA/ROCK通路后,检测上述指标的变化情况,以确定上述改变由RhoA/ROCK通路的调节所致。结果:1.临床筛查的结果:GDM患者胎盘组织中,RhoA蛋白表达水平显著高于正常对照组,有统计学差异(P<0.05);在GDM组患者血清标本中RhoA水平增加,并与孕周和糖化白蛋白(GB)呈正相关(r=0.17,P=0.018;r=0.221,P=0.042)。2.动物实验:经高脂饮食喂养,与正常妊娠小鼠比较,GDM组小鼠体重增加,糖耐量下降,空腹血糖及胰岛素,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)水平均升高,GDM动物模型建立成功,GDM组RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平上调,胰岛素信号通路蛋白(p-IRβTyr1361、p-IRS-1Tyr896、Akt、PAkt、GLUT4表达下调,但p-IRS-1Ser307和GLUT1表达上调)。3.体外细胞实验:(1)胰岛素抵抗(IR)组RhoA/ROCK1/ROCK2表达水平均较正常对照组(Control)升高;(2)IR组细胞葡萄糖消耗能力显著降低,在48h时降低约50%。与IR组相比,fasudil处理后的HTR-8/SVneo细胞葡萄糖消耗能力增加;(3)与对照组相比,在0、12和24小时未观察到细胞活力的差异。在48 h时,IR组HTR-8/SVneo细胞活力显著降低,给予fasudil后细胞活力呈剂量依赖性增加。IR组PCNA水平下调通过fasudil处理后好转。(4)IR组细胞凋亡比例增加。相反,fasudil给药显著降低了凋亡细胞百分比。另外,在IR的细胞中,bax和裂解的caspase-3水平上调,同时下调bcl-2。经fasudil给药后,bcl-2水平升高,但bax和裂解的caspase-3表达下降。(5)q RT-PCR的结果证实IR通过增加IL-1β,TNF-α,IL-6和IL-8 m RNA水平的变化加重炎症反应。与此相反,fasudil处理后,炎症因子水平呈剂量依赖性降低。(6)在IR组HTR-8/SVneo细胞中,RhoA,ROCK2,p-MYPT-1,p-IRS-1(Ser307)的表达上调,p-IR-β(Tyr1361),p-IRS-1(Tyr612)和p-Akt水平下调。fasudil给药后引起了RhoA,ROCK2,p-MYPT-1和p-IRS-1(Ser307)水平降低,并伴有升高p-IR-β(Tyr1361),p-IRS-1(Tyr612)和p-Akt的水平。但三组MYPT-1,IRS-1和Akt表达无明显差异。fasudil给药后促进了胰岛素处理的细胞中的GLUT-4核仁的核易位。(7)IR组细胞浆中NF-κB p65下调和胞核中的NF-κBp65p-IκB-α的上调,通过使用fasudil可改善并降低了核中NF-κB p65的表达。结论:通过体内外实验证实,RhoA蛋白在IR诱发GDM情况下表达增多,胰岛素信号通路受到抑制。在细胞试验中,验证了RhoA/ROCK通路影响IR的机制为抑制胎盘滋养层细胞的细胞增殖,增加细胞凋亡,加重炎症反应,抑制胰岛素信号通路及激活NF-κB信号通路实现。
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