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血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,全世界范围内有超过2.5亿人感染血吸虫,还有78个国家和地区的将近7.79亿人面临着被感染的危险;据不完全统计每年有超过20万人死于血吸虫病,并造成了巨大的经济损失。湖北钉螺(Oncomelaniahupensis)是日本血吸虫(Schistosomajaponicum)唯一的中间宿主,其在血吸虫病的传播和流行过程当中发挥着不可替代的作用。除此之外,湖北钉螺还可作为一种鱼类吸虫-外睾吸虫(Exorchissp.)的中间宿主,研究发现应用无害的外睾吸虫能够成功地在其媒介钉螺体内对血吸虫幼虫进行生物控制,即钉螺在先感染外睾吸虫之后可以拮抗再入侵的血吸虫幼虫,后进入钉螺体内的血吸虫幼虫发育全部不正常、受阻,并最终全部被杀死。本文首先对血吸虫病疫区江西省星子县鄱阳湖流域进行生物控制资源的初步调查,结果显示在2012-2016年间共解剖野生鲶鱼494条,其中感染外睾吸虫的鲶鱼共有325条,总的感染率约为65.79%,总的平均感染强度为14.21条;在2012-2015年间共检查了 19528粒钉螺,其中外睾吸虫阳性钉螺总数为216粒,感染率约为1.11%,血吸虫阳性钉螺为12粒,感染率约为0.06%。从调查结果可以看出鄱阳湖区鲶鱼外睾吸虫感染率很高,湖北钉螺外睾吸虫的感染率也要远远高于血吸虫的感染率,表明外睾吸虫的资源较为丰富,不仅能为后续的研究提供便利,更为重要的是能够为未来生物控制方法的普及和实施提供支持。鉴于目前在湖北钉螺内在分子和细胞机制等方面研究的文献资料极为匮乏,厦门大学生命科学学院的唐崇惕教授和郭跃博士、上海兽医研究所的林矫矫教授、上海交通大学生命科学学院的乔中东教授以及国家人类基因组南方研究中心的王升跃教授共同合作对四种不同感染情况的湖北钉螺转录组进行测序以及差异表达谱进行分析,我们从中筛选出了一些可能在生物控制过程中有着重要作用的蛋白质分子,例如MIF(Macrophage migration inhibitory factor,巨噬细胞迁移抑制因子)和TRX(Thioredoxin,硫氧还蛋白)等;通过数据分析、文献查阅和实验验证,并结合生物控制过程中所观察到的表型,我们确定了本文中所重点研究的目标分子湖北钉螺MIF,即OhMIF。MIF是一种具有多重功能的细胞因子,在宿主抵抗外来微生物和病原入侵以及免疫细胞促炎症反应中均发挥着重要的免疫调节功能。在本文中,我们根据钉螺转录组中得到的湖北钉螺MIF(OhMIF)全长cDNA序列,成功地从钉螺体内对OhMIF进行了克隆,接下来我们利用点突变以及原核表达系统成功地对重组OhMIF蛋白(rOhMIF)和其突变体OhMIFP2G重组蛋白(rOhMIFP2G)分别进行了表达和纯化,并对其互变异构酶活性进行了测定,结果显示rOhMIF呈现出依赖于第二位脯氨酸(Pro2)的D-多巴胺互变异构酶活性,并且该酶活性能够被哺乳动物MIF特异性抑制剂ISO-1所抑制,表明该结合位点是保守的;除此之外,我们又分别对rOhMIF和rHsMIF(人类MIF重组蛋白)的D-多巴胺互变异构酶活性的动力学常数进行测定和比较分析,结果显示出rOhMIF对底物的亲和力以及催化效率要均低于rHsMIF;接下来,我们通过实验证实rOhMIF还呈现出利用DTT作为还原剂来还原胰岛素的氧化还原酶活性,而哺乳动物MIF则是利用GSH作为还原剂;而且,我们还通过体外注射实验证实rOhMIF和其突变体rOhMIFP2G均能够促进ERK1/2的磷酸化和活化,表明rOhMIF的互变异构酶活性对于该功能的发挥并不是必需的。接下来,我们通过实验证实OhMIF在钉螺各个组织中均有表达,在钉螺血淋巴细胞中定位在细胞质;同时我们还发现当钉螺感染血吸虫之后,OhMIF的表达量有着明显的上调,表明其在钉螺对于血吸虫入侵进行免疫防御过程中可能发挥着重要的作用。为了能够更好地探究OhMIF在钉螺免疫系统中的功能,我们首先根据细胞体积和细胞颗粒密度对钉螺血淋巴细胞进行了较为系统的分类,并采用体外喂食法对OhMIF在钉螺体内的表达量进行敲低;实验结果显示OhMIF敲低之后能够显著地降低吞噬性血淋巴细胞在总的循环性血淋巴细胞中的比例,同时较大体积以及较高颗粒密度血淋巴细胞的比例也呈现出明显的降低趋势,表明OhMIF在血淋巴细胞的成熟和分化过程中具有重要的功能。除此之外,我们还通过实验证实OhMIF能够有效地促进吞噬性血淋巴细胞向着血吸虫感染部位进行迁移。由于我们从上述四种不同钉螺样品的转录组测序和差异表达分析中只是拿到了很少一部分数据,为了以后能够更好、更加深入地进行后续的研究,接下来我们又采用转录组与蛋白质组相结合的方式来探究生物控制作用的内在分子机制。结果显示共得到了 46162条独立的湖北钉螺unigene,利用iTRAQ技术共鉴定到了 3811个蛋白,分别对得到的基因和蛋白进行功能分类和注释分析,并以此作为数据库,对四种不同感染情况钉螺中差异表达的蛋白进行鉴定,然后针对其中我们比较感兴趣的两组差异蛋白进行更进一步的分析,即Common组(146个)和Only组(195个),经过功能分类与注释分析,找到了一些可能在钉螺免疫防御系统中起着关键作用的蛋白。综上所述,本文基于利用外睾吸虫在钉螺体内对血吸虫进行生物控制的表型、四种不同感染情况钉螺转录组测序和差异表达分析以及MIF的研究进展和功能综述,进而确定了本文所要研究的目标分子-OhMIF。接着我们又对OhMIF进行了鉴定及其生物学活性的测定和分析,发现OhMIF在不同吸虫感染情况钉螺体内以及不同时间血吸虫感染钉螺体内的表达量均呈现出显著的差异;接下来我们又通过实验证实OhMIF在钉螺对于血吸虫先天性免疫反应过程中发挥着重要的作用;同时为了以后更广泛、全面地探究该生物控制过程的内在机制,我们还通过转录组与蛋白质组相结合的方式鉴定出了一些可能在此过程中具有重要作用的差异表达分子。本文是首次对湖北钉螺免疫相关分子进行功能性的探究,相信本文中所采用的方法和手段或许可为以后钉螺中其它关键分子的研究提供模板,本文中的内容也将会有助于更进一步地探究和理解宿主与寄生虫的相互关系。但是由于这些方面研究的信息和材料尚且不足,很多的实验研究仍处于早期的探讨摸索阶段,难免会存在许多不足和短缺之处,我们今后会更加仔细、全面地对钉螺的免疫防御系统展开深入的研究,进一步地了解钉螺与寄生虫之间的相互作用关系,为血吸虫在钉螺体内的生物控制提供更加详细的科学依据。