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铁皮石斛(Dendrobium officinale iimuraetMigo)是兰科石斛属的草本植物,为中国历史上的珍稀中药材。味甘,性微寒。归胃、肾经。具有益胃生津,滋阴清热的功效。现代科学研究表明了其多糖为铁皮石斛最主要的有效成分,具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生物活性。并且多糖为具有复杂结构的天然大分子化合物,是生物体内的基本物质之一。具有低毒性、无副作用等优点,具有巨大的开发潜力。近年来,国内研究学者对铁皮石斛多糖进行了一系列的研究,并且取得了可喜的研究进展。并且随着研究不断地深入,多糖的分离纯化,以及构效关系研究越来越受到重视。目前为止,国内外的研究学者多采用DEAE阴离子交换树脂色谱柱,通过纯化水以及盐溶液对铁皮石斛粗多糖进行初步的分离,然后再采用凝胶色谱的方法对制得的多糖进一步纯化,制得纯化均一的多糖部位以及片段,并且将得到的均一多糖进行结构特征以及生物活性的研究。然而铁皮石斛多糖的研究仍存在一定的缺陷,以往研究的铁皮石斛纯化多糖多为水溶性多糖(多来通过DEAE阴离子交换树脂分离的时候,纯化水洗脱得到的多糖部位),然后将得到的水溶性多糖进一步的纯化、化学结构特征、生物活性研究。根据DEAE纤维素的离子交换的分离原理,纯化水洗脱的部位以及盐溶液洗脱的往往存在一定的区别,而正是这些差异导致了多糖的化学结构特征以及生物活性的差异。目前国内外的研究表明,很多植物多糖的盐水洗脱部位(盐溶性多糖)同样具有良好的生物活性,例如免疫调节,抗氧化,抗肿瘤,降血糖等,因此,对铁皮石斛盐溶性多糖研究有一定的必要性。并且盐溶性多糖在铁皮石斛粗多糖中占据一定的比例,是铁皮石斛多糖研究的重要部分之一,也是探索铁皮石斛特殊性成分以及铁皮石斛多糖独特结构特征,不可忽略的研究点,对丰富铁皮石斛多糖的研究具有一定意义和价值。因此,本研究展开铁皮石斛盐溶性多糖的系列研究,为铁皮石斛多糖的进一步深入研究提供基础。目的:采用多糖的提取分离纯化技术,制得铁皮石斛纯化均一的盐溶性多糖,研究铁皮石斛盐溶性多糖的化学结构特征以及生物活性,为进一步的深入研究奠定基础。方法:1.采用石油醚以及80%的乙醇除杂质成分后,通过水提醇沉法提取多糖,经Sevage试剂除去蛋白质后,得到铁皮石斛粗多糖(D.officina opolysaccharide,DOP),然后采用DEAE-52阴离子交换树脂,再以纯化水以及不同浓度的盐溶液(0.1 M,0.3 M,1.0M氯化钠溶液)对多糖进行初步地分离,主要收集纯化水洗脱的部位以及0.1 M NaCl溶液洗脱的部位,分别浓缩干燥,得到水溶性粗多糖(D.offcinale water-soluble polysaccharide,WDOP,由课题组另一位成员进行后续研究)及盐溶性粗多糖(SDOP),SDOP再通过葡聚糖凝胶Sephacryl S-300进一步的分离纯化,制得纯化的两个盐溶性多糖片段(D.officinale salt-soluble polysaccharide A and D.officinale salt-soluble polysaccharide B,SDOPA 和 SDOPB)。2.分析铁皮石斛多糖的提取分离纯化过程中,各多糖样品的转移率和得率;采用HPLC-PMP柱前衍生法分析铁皮石斛药材、粗多糖、盐溶性粗多糖、盐溶性纯化多糖片段的单糖组成;采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对铁皮石斛盐性多糖进行分子量测定以及均匀性分析;通过红外光谱,甲基化和核磁共振波谱对多糖的结构进行分析。综合以上的图谱数据推测多糖的结构特征。3.采用MTT法、中性红法以及Griess试剂分别检测铁皮石斛盐溶性多糖对巨噬细胞RAW264.7的活性、吞噬活性以及分泌NO的影响;通过MTT法测定多糖对脾细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞的增殖率的影响。初步评价铁皮石斛盐溶性多糖的免疫活性。4.通过MTT法探讨铁皮石斛盐溶性多糖对H2O2诱导氧化损伤细胞活性的影响;采用Hoechst 33258,并且借助显微镜技术,观察盐溶性多糖对氧化损伤细胞的细胞形态以及结构的影响。初步评价铁皮石斛盐溶性多糖在细胞模型上抗氧化能力。结果:1.铁皮石斛粗多糖DOP经DEAE-52阴离子交换树脂以及葡聚糖凝胶Sephacryl S-300分离纯化,获得了两个盐溶性多糖片段SDOPA和SDOPB。2.在铁皮石斛提取分离纯化过程中,粗多糖DOP、盐溶性粗多糖SDOP、盐溶性纯化多糖SDOPA以及SDOPB的转移率分别为18.89%、21.29%、19.34%和6.59%;得率分别为 18.89%、4.02%、0.78%、0.27%。3.铁皮石斛药材、DOP、SDOP、SDOPA和SDOPB中甘露糖和葡萄糖的比例分别为2.7:1.0、3.6:1.0、4.5:1.0、5.7:1.0、4.6:1.0。SDOPA 和 SDOPB 的分子量分别为3.94×105 Da和 3.62×105 Da,分散系数(d)分别为 1.74,1.77,并且 HPGPC 的图谱显示两者均为单一对称峰,说明SDOPA和SDOPB的均一性好。红外光谱扫描结果显示,SDOPA和SDOPB含有O-乙酰基团的特征吸收峰,两者都是含有β-糖苷键链接和吡喃环结构的多糖组分。甲基化和GC-MS的图谱结果进一步地分析证明了,两者均含有1,4-linked Manp和1,4-linked Glcp的结构,核磁共振(NMR)的图谱进一步证明铁皮石斛多糖组分SDOPA和SDOPB具有O-乙酰基结构,并且两者的都是以1,4-linked β-D-Manp和1,4-linked β-D-Glcp的结构组成的主链的葡甘露聚糖。4.铁皮石斛盐溶性多糖SDOPA、SDOPB和SDOP对巨噬细胞的增殖率有轻微的促进作用,以及对细胞的形态有一定的刺激作用。三者在剂量浓度(6.25-50 ng/mL)均能显著性提高巨噬细胞的吞噬活性(P<0.05),且随着剂量的升高,其促进作用提高。除此之外,铁皮石斛盐溶性多糖(6.25-50 μg/mmL)能显著性地促进细胞分泌NO(P<0.05),并且随着浓度剂量的升高以及作用时间的延长,细胞释放的NO的量越高。在淋巴细胞的免疫活性方面,铁皮石斛盐溶性多糖均能显著性促进小鼠脾细胞(6.25-50 μg/mL)和T淋巴细胞(12.5-50 μg/mL)的增殖率升高(P<0.05)。然而仅有 SDOPA(12.5-50 1g/mL)和 SDOPB(12.5-50 1g/mL)能促进 B 淋巴细胞的增殖(P<0.05),而SDOPB则对B淋巴细胞没有刺激作用。5.采用H2O2对细胞进行氧化损伤,建立RAW264.7细胞氧化损伤模型,确定模型损伤浓度为500 μM的H2O2作用2 h。铁皮石斛多糖SDOPA、SDOPB和SDOP(25-100 1g/mL)均能显著性地提高氧化损伤RAW264.7细胞的存活率(P<0.05)。且对氧化损伤细胞RAW264.7的形态结构具有保护作用,维持细胞的完整性,降低细胞的凋亡和死亡。结论:铁皮石斛粗多糖经DEAE-52阴离子交换树脂以及葡聚糖凝胶Sephacryl S-300分离纯化,可获得纯度较高的两个纯化均一的盐溶性多糖片段SDOPA和SDOPB,说明分离纯化方法可行。SDOPA 和 SDOPB 是主要由 1,4-linkedβ-D-Manp 和 1,4-linked β-D-Glcp 结构构成主链的葡甘露聚糖,且含有O-acetyl结构。初步的药效试验表明了铁皮石斛盐溶性多糖对巨噬细胞以及淋巴细胞具有一定的促进作用,并且铁皮石斛盐溶性多糖能够保护细胞免受氧化损伤,说明了其具有免疫调节以及抗氧化活性。铁皮石斛盐溶性多糖的结构特征以及生物活性的初步结果,可为进一步的深入研究,以及构效关系的分析提供研究基础,为铁皮石斛的开发利用提供参考。