嗜卷书虱（Liposcelis bostrychophila Badonnel）隶属于啮虫目Psocoptera、书虱科Liposcelididae、书虱属Liposcelis,是一种世界性分布的重要仓储害虫。由于化学药剂的不合理使用,嗜卷书虱已经对多种储粮保护剂、熏蒸剂以及温控、气调等防治措施产生了较高的忍耐力或抗性。以往对书虱抗逆机制的研究工作主要集中在生化水平层面,而关于书虱抗逆分子水平层面的研究较为匮乏。热激蛋白（Heat Shock Protein,HSP）是生物体面对极端温度或其他逆境胁迫时所产生的一类特定的应激蛋白。根据分子量的大小,热激蛋白可划分为HSP90、HSP70、HSP60、HSP40以及sHSP。本学位论文基于嗜卷书虱基因组和转录组数据对其HSP全家族基因进行鉴定,同时系统解析HSP70和HSP90家族基因在不同逆境胁迫下（如高低温、杀虫剂诱导等）的表达模式,并利用RNAi技术进一步阐释嗜卷书虱HSP70和HSP90的潜在生物学功能。本学位论文的主要研究结果如下:1嗜卷书虱热激蛋白（LbHSPs）全基因组鉴定与生物信息学分析基于嗜卷书虱基因组和转录组数据库,共鉴定获得61个LbHSPs基因,包括3个LbHSP90基因（相似度为43.36%）、8个LbHSP70基因（相似度为33.99%）、10个LbHSP60基因（相似度为40.97%）、35个LbHSP40基因（相似度为4.46%）以及5个LbsHSP基因（相似度为36.45%）。序列分析表明,LbHSPs所编码的氨基酸序列长度在99～1,004 aa之间,等电点在4.79～9.90之间,分子量在10.81～113.18 k Da之间。亚细胞定位显示LbHSPs分布在细胞质（42.62%）、细胞核（8.20%）、线粒体（24.59%）和内质网上（22.95%）。基因结构分析结果表明,不同LbHSPs所包含的内含子数目差异较大（0～27）,暗示着LbHSPs功能具有潜在的分化或多样性。LbHSPs各家族具有特异的家族保守基序,其中,LbHSP70s和LbHSP110s拥有相同的保守基序和保守结构域,说明二者可能在嗜卷书虱中具有相同的功能,同时也进一步支持将LbHSP110s并入LbHSP70家族的分类观点。基于氨基酸序列的系统发育树和contig定位分析发现,嗜卷书虱热激蛋白基因串联重复事件发生的频率较低,sHSP家族未发生基因数目大量扩增是导致嗜卷书虱HSP数目偏少的直接原因。2嗜卷书虱HSP70和HSP90表达模式解析2.1温度胁迫下嗜卷书虱转录组差异表达分析运用比较转录组学技术,构建了40℃（高温）、5℃（低温）以及27.5℃（对照）处理1 h后的嗜卷书虱转录组文库,对其差异表达基因的分析结果发现,高温胁迫后,共有1,050个基因显著性上调,1,404个基因显著性下调。低温胁迫后,嗜卷书虱仅有38个基因显著上调,59个基因显著下调。上述结果表明,嗜卷书虱对高温胁迫的响应程度更高。在高温胁迫后差异基因主要分布在化合物合成,运输和代谢通路,进一步分析发现,响应温度胁迫而显著性上调表达的HSPs共有17个,分别为5个LbHSP70s、4个LbHSP40s、4个LbsHSPs、2个LbHSP90s以及2个LbHSP60s。2.2 LbHSP70s和LbHSP90s在不同发育阶段的表达模式分析利用q PCR技术检测了LbHSP70s和LbHSP90s在卵、1龄至4龄若虫以及成虫期的mRNA转录表达水平。结果表明,LbHSP70.1-6/LbHSP110.1-2和LbHSP90.1-3等11个基因在嗜卷书虱不同发育阶段均有表达,且具有明显的差异表达模式。就LbHSP70s而言,LbHSP70.5、LbHSP70.6和LbHSP110.2在1龄、3龄、4龄若虫期和成虫期的表达量极低;LbHSP70.2、LbHSP70.4和LbHSP110.1在成虫期的相对表达量最高;LbHSP70.1和LbHSP70.3在各发育阶段的表达量相对稳定。此外,几乎所有LbHSP70s均在2龄若虫期相对高表达,暗示它们可能与嗜卷书虱2龄若虫阶段的生长发育或适应外界环境有关。同时,LbHSP70s在不同发育阶段的差异表达也暗示了其可能存在着功能分化。就LbHSP90s而言,与其他龄期相比,LbHSP90.1在1龄若虫期显著高表达;LbHSP90.2和LbHSP90.3在各发育阶段的表达量相对稳定,表明LbHSP90s参与了嗜卷书虱各生长发育阶段的生理活动过程。2.3 LbHSP70s和LbHSP90s响应不同温度处理的表达模式分析通过极端高、低温（35℃、40℃、45℃、–5℃、0℃以及5℃）分别处理嗜卷书虱成虫2 h、4 h、6 h以及8 h,解析LbHSP70s和LbHSP90s的响应表达模式。结果发现,LbHSP70.4、LbHSP70.5和LbHSP110.1对高温胁迫（40℃和45℃）显著响应,其中LbHSP70.5极显著上调,在40℃处理2 h和4 h后,其表达量较对照组（27.5℃）而言,分别上调8,328和9,390倍。其他LbHSP70s在高温胁迫后的表达量无显著性变化,仅LbHSP70.3在40℃处理8 h后有显著上调。此外,LbHSP70s对低温胁迫的响应不敏感,但随着处理温度的降低,LbHSP70s的表达量有下降的趋势。据上述结果,我们推测LbHSP70.5是嗜卷书虱应对极端高温的关键HSP基因,LbHSP70.4、LbHSP70.5和LbHSP110.1在嗜卷书虱应对高温胁迫的防御过程中发挥着重要作用。与LbHSP70家族基因有所不同,LbHSP90s响应高低温胁迫的表达模式更加多样,如LbHSP90.1在40℃和45℃等高温胁迫后显著上调,但对低温胁迫的响应表达存在处理时间效应;LbHSP90.2在45℃高温处理下,均显著上调表达,而在其他不同高温处理不同时间的条件下,与对照组表达量相比无显著性变化（45℃、8 h处理除外）;就低温胁迫处理而言,LbHSP90.2的表达量仅在5℃处理6 h和8 h后有所上调。LbHSP90.3在不同温度胁迫处理下无显著性表达变化。综上所述,我们推断LbHSP90.1和LbHSP90.2可能在嗜卷书虱抵御高、低温胁迫的过程中均发挥了一定的作用,而个别的LbHSP90s对高温胁迫的响应更加敏感。2.4杀虫剂诱导对LbHSP70s和LbHSP90s转录表达水平的影响针对不同的杀虫剂,LbHSP70s和LbHSP90s的响应表达模式有所不同,且其表达量亦受处理时间和恢复时间效应的影响。LbHSP70.4分别在阿维菌素和溴氰菊酯诱导处理（0.5 h和1 h）以及马拉硫磷和高效氯氰菊酯诱导3 h处理后显著上调。LbHSP70.5在马拉硫磷、溴氰菊酯和高效氯氰菊酯3 h处理后显著上调。其他LbHSPs对于阿维菌素和溴氰菊酯的诱导存在剂量依赖性,普遍在0.5 h和1 h处理时间下显著性高表达;而对于马拉硫磷和高效氯氰菊酯的处理而言,需要一定的剂量积累（3 h后）才能诱导LbHSPs高表达。在药剂处理0.5 h后的系列恢复时间的LbHSPs表达量检测结果表明,阿维菌素诱导处理恢复36 h后LbHSPs（除LbHSP70.5）均显著高表达;溴氰菊酯诱导后,LbHSP70.4和LbHSP70.5的表达量显著上调;然而,在马拉硫磷和高效氯氰菊酯诱导后,仅有LbHSP70.5的表达量显著上调。可见,LbHSP70.5可能是嗜卷书虱在抵御化学药剂诱导/胁迫过程中的重要应激基因。3基于RNAi技术的LbHSP70s和LbHSP90s的功能探究基于LbHSP70.4、LbHSP70.5、LbHSP90.1和LbHSP90.2在不同逆境胁迫下均可被显著诱导表达的现象,本论文采用RNAi技术进一步验证其功能。通过体外合成目标基因ds RNA并采用饲喂法将其递送至嗜卷书虱成虫体内,于48 h后利用q PCR技术检测目的基因的沉默效率。结果表明,LbHSP70.4、LbHSP70.5、LbHSP90.1和LbHSP90.2均能被有效沉默,沉默效率分别为38.59%、59.24%、43.29%和37.46%。当干扰上述目标基因的表达后,极端高温处理嗜卷书虱成虫的死亡率均显著提高。与对照组相比,嗜卷书虱分别饲喂dsLbHSP70.4、dsLbHSP70.5和dsLbHSP90.2后,其在高温（45℃）胁迫后的死亡率均显著提高,与对照组相比,分别提升1.67、2.26和1.91倍;当饲喂dsLbHSP90.1后,嗜卷书虱经高温处理后死亡率亦有所提高,但并不显著。综上所述,LbHSP70.4,LbHSP70.5和LbHSP90.2是嗜卷书虱抵御热胁迫的关键基因。利用RNAi敲低LbHSP70.4和LbHSP70.5的表达量后,测定马拉硫磷和高效氯氰菊酯(LC20剂量)对嗜卷书虱的毒力变化。分别沉默LbHSP70.4和LbHSP70.5后,嗜卷书虱在杀虫剂亚致死剂量的处理下,死亡率均显著升高。其中,高效氯氰菊酯处理后的死亡率是对照组的3.12和3.83倍;马拉硫磷处理后的死亡率是对照组的1.70和1.71倍。由此可见,嗜卷书虱HSP70s的高水平表达可能同时增强了该虫对杀虫剂和高温的耐受能力,从而导致该害虫的暴发成灾和快速扩张。