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玉米象(Sitophilus zeamais Motschulsky)是鞘翅目储粮害虫,对粮食储存造成了严重威胁。化学熏蒸剂溴甲烷在全球范围内禁用、贮藏害虫对磷化氢抗药性日渐加剧、硫酰氟残留形成强温室气体引起人们的广泛担忧,仅有的几种熏蒸剂面临严重挑战,目前研究学者普遍认为“生物熏蒸”是储藏物害虫管理的有效途径之一。辣根素(Allyl isothiocyanate,简称AITC)是近年来开发出的一种植物源熏蒸剂,对玉米象等储粮害虫具有较好的熏蒸活性,但其熏蒸作用分子机制仍在探究之中。本实验室前期研究表明,辣根素对玉米象作用的潜在分子靶标为细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase,简称COX),但其与COX相互作用机制和结合位点仍值得深入探究。RNA干扰(RNAi interference,简称RNAi)是一种转录后基因沉默的机制,可用于验证药物靶标。本文利用RNAi探究COX核心亚基生物学功能,并研究AITC对其生物学功能的影响,得到如下结果:1.玉米象COX核心亚基时空表达量。COXⅡ、COXⅢ随着虫龄增加表达量逐渐增大,20日龄幼虫表达量最高,后续龄期表达量逐渐下降,COXⅠ随着虫龄增加,表达量逐渐增大,在1日龄蛹期表达量最高,并在随后龄期表达量逐渐下降;在18日龄幼虫中COXⅠ、COXⅡ以及COXⅢ在中肠表达量最高,而在脂肪体、头部以及表皮表达量依次下降。2.合成长度分别为493 bp、499 bp和411 bp的干扰片段dsRNACOX Ⅰ、dsRNACOXⅡ和dsRNACOX Ⅲ,并微量注射18日龄玉米象幼虫,检测注射后COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ的基因表达量、统计试虫死亡率、观察表型变化。dsRNACOX Ⅰ、dsRNACOXⅡ和dsRNACOX Ⅲ的干扰效率不具有显著的剂量效应;对于时间效应来说,dsRNACOX Ⅰ和dsRNACOX Ⅱ干扰后,随着时间的增加干扰效率呈现上升趋势,而dsRNACOX Ⅲ干扰效率呈现下降趋势。18日龄玉米象幼虫注射0.75%NaCl、100 ng dsRNACOX Ⅰ、50 ng dsRNACOX Ⅱ 和 50 ng dsRNACOX Ⅲ 24 h 后,试虫死亡率分别为5.55%、23.33%、22.45%和14.44%,48h后试虫死亡率分别为7.78%、42.22%、53.87%和 61.11%,72 h 后试虫死亡率分别为 10%、75.55%、71.80%和 82.22%。100 ng dsRNACOX Ⅰ、50 ng dsRNACOX Ⅱ 和 50 ng dsRNACOX Ⅲ 注射后,试虫均呈现幼虫死亡头部发黑,蛹死亡后口器和翅发黑的表型。3.检测玉米象18日龄幼虫COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ干扰之后,COX活性变化以及玉米象线粒体亚细胞结构的变化。注射100 ng dsRNACOX I36 h之后,试虫COX酶活性显著低于阴性对照注射0.75%NaCl,48 h显著高于阴性对照。而50 ng dsRNACOX Ⅱ 和 50 ng dsRNACOX Ⅲ 处理后,试虫COX酶在24h、36h和48h均与阴性对照无显著差异。注射0.75%NaCl 36 h后,玉米象线粒体轮廓明显嵴清晰可见,而注射 100 ng dsRNACOX Ⅰ、50 ng dsRNACOX Ⅱ 和 50 ng dsRNACOX Ⅲ 36 h 后,玉米象线粒体边缘模糊、嵴稀疏甚至呈现空泡化,线粒体破碎分解。4.检测玉米象18日龄幼虫RNAi之后对辣根素敏感性变化。测试了 95%辣根素原油对18日龄玉米象幼虫的熏蒸毒力,毒力方程为:y=5.05x-4.425,LC20为3.997 μL/L。试虫在注射100 ng dsRNACOX Ⅰ 24 h和48 h后对辣根素敏感性显著上升,在100 ng dsRNACOX Ⅰ注射72 h后对辣根素敏感性无显著变化;试虫在注射50 ng dsRNACOX Ⅱ24 h之后对辣根素敏感性显著上升,48 h、72 h敏感性无显著变化;50 ng dsRNACOXⅢ在24 h对辣根素敏感性无显著变化,48 h、72 h敏感性显著降低。综上,我们推测辣根素极有可能作用于玉米象的核心亚基COXⅠ和COX Ⅱ,特别是COX Ⅰ核心亚基,但其具体的结合位点有待深入研究。本研究结果为dsRNACOX核心亚基高效利用以及dsRNACOX核心亚基与AITC复配应用提供了基础数据,也为该类小分子核酸农药的研究和开发奠定了基础。