锌离子刺激巨噬细胞分泌的外泌体对内皮和成骨细胞功能的影响

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新骨和血管生成对于植入体骨整合都至关重要,且二者均受到巨噬细胞的免疫调控。纯锌(Zn)及其合金是一种新型的可降解生物材料,其腐蚀产物Zn离子可调节巨噬细胞的功能。外泌体是细胞内通讯的新型载体,然而巨噬细胞源性外泌体是否参与Zn离子介导的巨噬细胞免疫调节过程仍不明确。本课题首先采用不同浓度的Zn离子刺激巨噬细胞,并通过超速离心法提取相应上清液中的巨噬细胞外泌体。之后利用扫描电子显微镜和蛋白质印迹(Western blot)两种方式对外泌体进行了鉴定。最后将提取的不同组别的外泌体孵育内皮与成骨细胞,评估了Zn离子作用下巨噬细胞源外泌体对两种细胞形态、骨架、黏附能力等,以及对内皮成血管和成骨分化能力的影响。综合本论文工作,所取得的研究结果如下:(1)低浓度的Zn离子对巨噬细胞的增殖有促进作用,但各组间无显著差异。当Zn离子浓度达到500μM及以上时表现出细胞毒性。Zn离子刺激对巨噬细胞形态无显著影响,但会下调巨噬细胞M1和M2表型相关基因的表达。(2)通过SEM形貌观察和蛋白质免疫印迹检测手段确认从Zn离子刺激巨噬细胞所提取的细胞外囊泡为外泌体。外泌体在SEM下呈圆球型,其尺寸主要分布在30~150nm之间。外泌体EDS检测结果显示Zn离子对巨噬细胞外泌体的分泌无显著影响,但会增加外泌体中的Zn含量。(3)巨噬细胞源性外泌体可被内皮细胞摄取。无Zn离子刺激的巨噬细胞分泌的外泌体对抑制内皮细胞的迁移能力无显著性影响,而Zn离子刺激巨噬细胞后分泌的外泌体会促进其成血管能力,对内皮细胞的黏附、NO合成和VEGF的分泌有促进作用,其中Exo-Zn20组效果最为明显。(4)巨噬细胞源性外泌体可被成骨细胞摄取。外泌体可以促进成骨细胞活性,上调碱性磷酸酶的活性,同时对成骨细胞的Ⅰ型胶原分泌有促进作用,其中Exo-Zn4组效果最为明显。本研究表明,Zn离子刺激巨噬细胞分泌的外泌体可促进内皮细胞迁移(血管生成的关键步骤)并上调成骨细胞分化的早期标志物成骨细胞ALP活性,促进Ⅰ型胶原分泌,从而丰富了巨噬细胞的免疫调节机制。
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