OCT4在胚胎早期发育,尤其是维持细胞多能性等方面具有重要调节作用。斑马鱼是重要的模式生物,建立荧光标记oct4基因鱼为开展鱼类干细胞研究和应用奠定基础。本文通过构建带有TOL2转座子的PBLK-oct4-EGFP质粒,获得了绿色荧光标记oct4基因的转基因鱼(F0代);结合雌核发育技术,建立了一种快速制备纯合转基因鱼的方法。具体研究结果如下:1、克隆斑马鱼oct4基因的启动子片段,对PBLK质粒骨架和带有oct4启动子的pMD18-T-oct4质粒同时进行双酶切,利用T4连接酶将oct4启动子连接到酶切后的PBLK质粒上,成功构建了全长为7338bp的带有TOL2转座子的PBLK-oct4-EGFP融合蛋白质粒。2、将PBLK-oct4-EGFP质粒和TOL2转座酶mRNA混合液显微注入斑马鱼受精卵中,获得约53%的绿色荧光胚胎(F0代)。荧光定量PCR对oct4和egfp基因在F0代胚胎中的表达分析表明:斑马鱼oct4基因具有母源性基因表达的特点,合子核基因在囊胚期表达旺盛,随着胚胎细胞的分化,oct4基因表达量随之降低。筛选到的F0代斑马鱼卵巢组织中的卵细胞及产出卵子中均可观察到绿色荧光。3、以遗传物质灭活的红鲫精子作为刺激源,将转基因斑马鱼F0所产的卵子激活,结合热休克抑制第一次有丝分裂进行倍性操作;挑选荧光胚胎,直接获得Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼。对比传统的测交再自交的转基因鱼纯合方法,通过雌核发育技术,节省了选育时间,是一种快速获得纯合转基因鱼的方法。4、剪取转基因斑马鱼纯合个体尾鳍组织,结合细胞培养技术,建立了Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼尾鳍成纤维细胞系,为鱼类干细胞发育生物学和诱导多能性干细胞研究提供了重要材料来源。结论:oct4基因在维持细胞多能性方面具有重要作用,是重要的干性因子。在构建PBLK-oct4-EGFP质粒基础上,通过显微注射获得oct4基因荧光标记斑马鱼;结合雌核发育技术,在F1代成功制备了Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼纯合个体;并建立了Tg(oct4:EGFP)转基因斑马鱼纯合个体尾鳍成纤维细胞系。oct4基因荧光标记鱼和荧光标记细胞系的建立将在鱼类发育生物学、生殖干细胞生物学、诱导多能性干细胞等研究中获得广泛的应用,具有重要的科学价值;同时通过雌核发育创制纯合转基因鱼,打破了通过测交再自交(需历经至少3代)得到纯合转基因斑马鱼的传统方法,具有重要的应用价值。