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甘氨酸脱羧酶(P蛋白)(glycine dehydrogenase,GLDC)是线粒体中甘氨酸脱羧复合酶四聚体复合物中的一个组分,负责催化甘氨酸脱氨和氧化脱羧。最新的研究表明,GLDC是一个与细胞代谢有关的致癌基因,在肿瘤干细胞中呈高表达,过表达GLDC能诱导正常细胞发生转化并形成肿瘤;GLDC在人类多种恶性肿瘤组织中呈高表达并与患者的不良预后密切相关。因此,GLDC有望成为新的抗肿瘤药物治疗靶点。鉴于此,本研究利用GLDC基因的启动子,构建以荧光素酶报告基因载体为基础的药物筛选模型,并从本实验室的中药有效成分样品库中筛选可抑制GLDC表达的天然化合物,并对筛选出的阳性化合物的GLDC表达抑制作用的分子机制和抗肿瘤活性进行了深入探讨,主要内容包括:(1)构建GLDC基因启动子的荧光素酶报告基因载体:利用PCR方法从293T细胞基因组中扩增GLDC基因的转录起始位点上游2186至113间的启动子区,并连接入pGL3-basic载体,构建GLDC启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-GLDCP。经荧光素酶活性检测结果证实,所获得的GLDC启动子具有较高的活性;(2)GLDC表达抑制剂的筛选:利用pGL3-GLDCP报告基因载体,对本实验室中药库中300余种中药单体及中药有效组分进行筛选,发现TI13、TI102两种天然化合物能够显著抑制GLDC基因启动子的活性,并在mRNA水平和蛋白水平进一步确认了TI13、TI102对GLDC表达的抑制作用;(3)TI13、TI102抑制GLDC表达的分子机制研究:利用一系列转录因子荧光素酶报告基因载体以及相关信号蛋白的免疫印迹分析发现,TI13、TI102分别显著抑制卵巢癌细胞株A2780中磷酸化ERK和磷酸化AKT水平;同时我们还证明ERK/MAPK和PI3K/Akt信号通路参与调节GLDC的表达,因此推测TI13和TI102可能分别通过抑制ERK/MAPK和PI3K/AKT信号通路来抑制GLDC的表达;(4)TI13和TI102基于抑制GLDC表达的抗肿瘤功能研究:首先利用MTT法证明TI13和TI102可导致卵巢癌细胞株A2780的细胞活力明显下降;其次利用软琼脂克隆形成实验证明这两种化合物可显著抑制A2780细胞的锚定非依赖性生长能力;经初步的流式细胞术分析还发现TI13和TI102可引起A2780细胞中肿瘤干细胞表面标记物CD44阳性细胞数降低;最后,通过检测细胞上清中的乳酸含量证明TI13和TI102可显著降低A2780细胞的乳酸代谢水平。综上,本研究利用GLDC基因启动子调控的荧光素酶报告基因载体,筛选获得可抑制GLDC表达的天然化合物TI13和TI102,并初步阐明TI13和TI102通过抑制ERK/MAPK或AKT信号通路来抑制GLDC表达的分子机制,同时进一步揭示抑制GLDC表达的TI13和TI102可明显抑制卵巢癌细胞A2780的细胞活力和锚定非依赖性生长能力,降低其肿瘤干细胞表面标志物CD44阳性细胞数及细胞的乳酸代谢水平。本研究为研发针对肿瘤干细胞的抗肿瘤药物提供了新的思路和实验基础,同时亦为进一步开发天然药物来源的抗肿瘤药物提供了备选天然化合物。