光学显微镜是人类探索和了解微观世界的重要工具,但是光的衍射限制了光学显微镜的分辨能力,使其无法区分相距200 nm以内的微观结构。超分辨成像技术打破了光学衍射极限,将光学显微镜的分辨率提升1~2个数量级。受激发射损耗(Stimulated emission depletion,STED)超分辨成像技术是第一个在理论上提出,并在实验中实现的远场超分辨成像方法。在STED技术中,超分辨的实现是通过一束波长红移的损耗激光对激发光斑点扩展函数进行压缩来完成的。虽然STED超分辨成像技术具有快速成像和无需后期图像重构的优势,但是过高的损耗激光功率和复杂的成像系统限制了其发展和应用。本论文针对目前STED超分辨成像技术中损耗激光能量过高和损耗激光波前畸变影响成像质量的问题,提出如下解决方案:为了在较低损耗激光功率下实现较高的成像分辨率,提出增加荧光寿命以降低饱和功率和相位图分析方法提取光子的两种方法;针对损耗激光波前畸变影响成像质量的问题,提出一种基于遗传算法的波前补偿方法,通过恢复损耗激光的原始波前实现STED成像质量和成像深度的提高。本论文的主要研究工作如下:1.搭建了一套脉冲型STED超分辨成像系统,利用荧光珠和生物细胞样品对成像系统进行标定,分别实现了52 nm和60 nm的横向空间分辨率。2.结合荧光寿命成像技术,将STED强度成像系统拓展为超分辨荧光寿命成像系统。在此系统中研究了共聚焦和STED成像模式下激光功率和照射时间对荧光寿命的影响。研究结果表明共聚焦成像模式下荧光寿命与激发光功率无关,STED成像模式下荧光寿命随损耗激光功率的增加而减小。此外,延长激光照射时间会导致荧光寿命的增加,进而降低荧光探针的饱和功率,因此在相同的损耗激光功率下获得了更高的空间分辨率。3.通过STED超分辨荧光寿命成像系统采集荧光信号,利用相位图分析方法进行光子提取。通过将STED相位中心坐标和坐标原点之间的连线作为界限,提取更靠近共聚焦相位中心坐标的光子,摒弃剩余的寿命变化较大的光子,可以进一步提高STED图像的分辨率。4.利用遗传算法搜索局部最优解的能力,编写基于遗传算法的像差校正程序,用于对损耗光斑进行像差校正。实验系统中波前相位的调制和环形损耗光斑的形成仅通过一个空间光调制器来完成,可以在不改变原有系统的前提下实现像差校正。通过使用金纳米颗粒的背向散射信号作为遗传算法优化的反馈,能够快速的补偿畸变的波前。研究结果表明:对损耗激光进行波前校正可以提高厚样品的STED成像质量,并在斑马鱼视网膜样品和斑马鱼胚胎切片样品中分别实现了深度为24μm和100μm的超分辨成像。本论文工作的创新点包括:1.基于STED超分辨荧光寿命成像系统,发现了荧光寿命随激光照射时间增加的现象。在STED成像模式下,延长激光照射时间降低了荧光探针的饱和强度,进而在相同损耗激光功率下实现了分辨率的提升。2.利用相位图分析荧光寿命数据的能力,提出将STED图像的相位中心坐标和坐标原点之间的连线作为界限,提取更靠近共聚焦相位中心坐标的光子,提高了STED超分辨成像技术在低损耗激光功率下的分辨率。3.将遗传算法用于厚样品STED超分辨成像时的像差校正,通过对成像系统中的损耗激光进行波前补偿,在斑马鱼视网膜样品和斑马鱼胚胎切片样品中分别实现了24μm和100μm的成像深度。与像差校正之前的超分辨图像相比,像差校正提高了STED图像的信号强度和分辨率。