球孢白僵菌侵染毒力关键因子筛选和功能鉴定

来源 :海南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xuzuhua
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海南高温高湿的气候条件决定了海南“宜桑不宜蚕”。因此,海南省大力发展果桑、药桑、茶桑、菜桑等特色桑园供人食用。然而海南地处热带地区,年均气温在15.5-26.7℃之间,农林害虫没有低温风险,发生情况较内陆地区更为猖獗。因此亟待研究桑园虫害的绿色防控技术,实现桑产业的绿色可持续发展。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)虽然是研究最早、应用最广的生防真菌,但是其侵染毒力受多因素影响,关键毒力因子尚不明确。此外,菌株产孢量退化问题严重影响生防制剂的生产效率以及田间生防应用效果。本研究筛选了侵染毒力差异和孢子产量差异的4个球孢白僵菌菌株,Bbcaasipp-Hv(高毒力)、Bbcaasipp-Lv(低毒力)、Bbcaasipp-Hs(高产孢量)和Bbcaasipp-Ls(低产孢量);通过高通量转录组学技术筛选差异基因,通过基因过表达实验对差异基因功能验证。取得以下研究成果:1、侵染毒力和产孢量差异菌株的转录组文库构建与数据分析(1)通过高通量测序技术、文库的质控分析和实时定量PCR验证,分别构建了Bbcaasipp-Hv vs Bbcaasipp-Lv和Bbcaasipp-Hs vs Bbcaasipp-Ls 2个高质量转录组文库。组装获得16467个单基因簇(Unigenes),平均长度1747 bps,序列信息27.43 Mb;完成13221个Unigenes的ORF分析,10983个Unigenes的功能注释;分析得到5448个SSR,14661个SNP。(2)通过数据库比对,筛选注释了1181个侵染毒力差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),聚类于与胞外水解酶的诱导表达、翻译、修饰、分泌以及调控菌丝异化发育成侵入钉相关的翻译后修饰-蛋白质转换-伴侣(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)、次生代谢产物生物合成-运输-分解代谢(Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism)、氨基酸转运与代谢(Amino acid transport and metabolism)、脂质体转运和代谢(Lipid transport and metabolism)、能量生产和转换(Energy production and conversion)、酮体合成与降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化(Pentose and glucuronate interconversions)、核酸切除修复(Nucleotide excision repair)、丝裂原活化激酶信号通路(MAPK signaling pathway)、赖氨酸降解(Lysine degradation)等KOG(Eukaryotic Ortholog Group)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路。(3)同时筛选出了1080个产孢量DEGs,聚类于与分生孢子发育相关的有丝分裂、能量代谢调控、次生代谢产物合成、酮体代谢、分子伴侣等KOG和KEGG途径,包括氨基酸转运与代谢(Amino acid transport and metabolism)、次生代谢产物合成、转运与分解代谢(Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism)、脂质体转运与代谢(Lipid transport and metabolism)、翻译修饰、蛋白质转换、伴侣(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)、能量产生和转换(Energy production and conversion)等。2、球孢白僵菌胞外几丁质酶(Bbchitinase)在侵染过程中的作用(1)球孢白僵菌胞外总几丁质酶酶活与半数发病时间(MMT)和半数死亡时间(LT50)相关性不显著,但是几丁质酶抑制剂处理会显著降低菌株的侵染毒力;(2)实时定量PCR结果表明球孢白僵菌侵染毒力仅与Bbchitinase-1表达水平呈正相关,而与Bbchitinase-2的表达水平无相关性;(3)时空表达模式分析表明,Bbchitinase-1在侵染家蚕的早期(12-24 h)上调表达,而Bbchitinase-2在家蚕侵染早中期(18-30h)微弱上调表达,而在感染后期(54-84 h)显著上调表达;说明Bbchitinase-1可能参与菌株的早期侵染的体壁穿透过程,而Bbchitinase-2可能与晚期侵染过程中菌丝的大量增殖代谢相关;(4)Bbchitinase-1和Bbchitinase-2的进化树分析、蛋白二级结构预测和蛋白三级结构预测,均表明二者属于不同的几丁质酶家族,存在显著的结构差异和活性结构域,推测二者具有不同的生理功能,印证了时空表达模式分析结果;(5)过表达实验结果表明,过表达Bbchitinase-1能够显著提升球孢白僵菌的侵染毒力,MMT提前14 h,LT50减少16 h;过表达Bbchitinase-2菌株的菌丝营养生长量则显著提高,菌丝生长速度为由4.23±1.32 mm/d提高到4.91±1.06 mm/d。结论:本论文构建了球孢白僵菌侵染毒力和产孢量差异的转录组文库,有助于筛选高毒、高效菌种的基因靶标;球孢白僵菌胞外几丁质酶在其侵染家蚕过程中起到不同的生理功能:Bbchitinase-1是侵染毒力关键因子,而Bbchitinase-2则可能参与菌丝营养生长的代谢调控。
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