类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）是一种存在于水和土壤中的革兰氏阴性杆菌,主要分布于地球南、北纬20°之间的热带、亚热带国家和地区,当前世界上流行程度最高的两个地区分别是澳洲地区和东南亚地区,流行尤其集中于澳大利亚北部和泰国。类鼻疽伯克霍尔德菌能够感染人类并导致类鼻疽病,临床上治疗困难、病死率高,平均病死率可达到40%;而抗生素选择不合理时,病死率甚至能超过70%。由于临床耐药率高,部分患者会数十年处于慢性感染或带菌状态,严重威胁人类的健康,也给流行地区的公共卫生管理带来了巨大压力。海南岛是我国大陆地区类鼻疽伯克霍尔德菌最主要的流行地区,1989年三亚市报道了海南岛首例类鼻疽病病例,进入本世纪后,随着对该病原的认识和临床诊断技术的不断提升,临床报道的病例数量逐年增加,海南当地的防治压力也愈加严峻。当前,我国针对类鼻疽伯克霍尔德菌在遗传多样性和分子流行病学等方面的研究,仅限于分辨率较低的传统分子生物学方法,例如多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）、多位点串联重复序列分析（multilocus variable-number tandem repeat analysis,MLVA）等,而基于全基因组的研究依然是空白。研究目的:本研究旨在全面掌握海南类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组流行病学特征,包括种群结构与遗传多样性,传播关系,以及基因组中致病能力相关遗传元件的分布与变异情况,从而为该病原的监测、防控、临床治疗等工作提供基础理论依据。研究方法:1.数据集准备本研究共有1654株类鼻疽伯克霍尔德菌基因组数据纳入分析,包括122株新测序的海南菌株,以及1532株公共基因组序列。新测序的海南菌株采样自海南岛内12个不同的县市,包括119株临床菌株和3株环境菌株,采样时间为2002～2018年间。公共基因组序列下载于美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）数据库,包括截止到2019年3月的所有已发表基因组数据,这些菌株采样自澳大利亚和泰国等全球22个不同国家或地区,菌株分离时间为1942～2018年间。2.全基因组测序提取新分离海南菌株的全基因组DNA,经检测质量合格后送测序公司（诺禾致源）进行细菌全基因组测序,测序平台为Illumina Nova Seq 6000,测序文库大小为350 bp,测序reads为双端150 bp。3.质控及组装使用软件Trimmomatic v0.38过滤测序结果中低质量的数据,然后利用软件shovill对过滤后的reads进行从头组装,组装后的基因组草图序列已上传至NCBI,Bio Project编号为PRJNA669904。4.变异检测选择菌株K96243的完成图基因组（NC＿006350.1,NC＿006351.1）作为参考序列来鉴定单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点。首先使用MUMmer软件包将1654株类鼻疽伯克霍尔德菌基因组序列分别比对到参考菌株基因组,从而获得了核心基因组与核心基因组SNP矩阵,此外,为保证SNP鉴定结果的可靠性,本研究删除了位于重复区和测序质量值低的SNP,仅将高质量值的SNP纳入了后续分析。5.系统发育分析首先将矩阵格式的SNP数据集转换为FASTA格式,然后用Fast Tree v2软件构建最大似然（Maximum Likelihood,ML）树,所有参数都为默认参数,生成的系统发育树使用在线软件i TOL（https://itol.embl.de/）进行可视化展示。6.种群结构分析使用hierBAPS（hierarchical Bayesian Analysis of Population Structure）软件基于核心基因组鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌种群结构,该软件的一个关键参数为预设最大种群数量,即K值,本研究首先分别预设K值为100,200和300进行计算,根据计算结果确定最优K值以及种群鉴定的结果。7.传播关系分析首先鉴定海南主要谱系的核心基因组和SNP,通过Gubbins软件去重组后,利用软件RAx ML-NG v.0.9构建最大似然树（ML tree）,然后以系统发育树和菌株的采样地点作为输入文件,通过软件phytools v0.5推断不同采样地点的菌株之间的传播方向并计算传播次数,为了增加计算结果的可靠度,迭代计算100次,取中位数为传播次数。8.毒力因子与耐药基因分析分别通过BLASTn与软件RGI v5.1.1将所有菌株基因组序列与毒力因子数据库（Virulence Factor Database,VFDB）核心库（set A）以及耐药基因数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD）进行比对,以鉴定本研究中数据集的毒力因子和耐药基因,coverage和identity值均大于70%认为该基因存在,否则为缺失。其次,将本研究中所有菌株基因组序列通过BLASTn与三种外排泵（Amr AB-Opr A,Bpe AB-Opr B和Bpe EF-Opr C）的泵调节基因:Amr R（BPSL1805）,Bpe R（BPSL0812）,Bpe T（BPSS0290）,Bpe S（BPSL0731）,β内酰胺酶基因Pen A（BPSS0946）以及青霉素结合蛋白3基因（penicillin-binding protein 3,PBP3,[BPSS1219]）的基因序列进行比对,然后通过软件MEGA v7.0.14将比对结果进行多序列比对后检查点突变、插入、缺失等突变情况。研究结果:1.海南类鼻疽伯克霍尔德菌的种群结构本研究菌株共被划分成16个种群（group 1～16）,海南菌株分布在其中的9个种群中,根据各种群内海南菌株的比例,以5%为界筛选出5个海南菌株的主要种群:group 1:12.3%,group 3:31.1%,group 9:13.1%,group 11:8.2%,group 15:15.6%,其余的少量海南菌株分散在其他4个少数种群中。2.海南与国际间的菌株传播事件本研究中共鉴定出6个跨国和跨地区的传播事件:包括2次新加坡向海南的传播事件,1次海南向新加坡的传播事件,1次泰国向海南的传播事件,1次海南向我国台湾地区的传播事件以及1次海南向马来西亚的传播事件,结果表明,海南菌株有泰国和新加坡两个输入源头,此外,海南类鼻疽伯克霍尔德菌不仅存在来自东南亚国家的输入,同时也向周边国家和地区输出,包括新加坡、马来西亚以及我国台湾地区。经过计算,这些跨国、跨地区的相互传播事件进化时间在10到39年间。3.海南菌株在岛内不同城市间传播事件本研究共鉴定出21次本地传播事件,其中18次传播事件起源自海南岛南部的两个热点城市（hotspot）:三亚和陵水,然后传向了海南岛的北部、西部和东部的其他城市。经过计算,除了两次三亚向陵水的传播事件进化时间为73年和41年外,其余海南本地跨城市传播事件的进化时间都在20年内。4.毒力因子鉴定结果本研究中共鉴定出160个毒力因子,主要与以下几个功能相关:细胞移动;细胞内物质交换、分泌和囊泡转运;细胞壁、细胞膜合成;信号转导等。功能各异的毒力因子表明类鼻疽伯克霍尔德菌具有强大的致病潜能。此外,group 1中的海南菌株还携带了一种特殊的毒力基因boa B,与粘附、侵袭功能相关。5.耐药基因研究结果本研究在多个临床耐药相关基因中鉴定出多种突变,包括点突变（point mutation）和基因片段的获得缺失（indel）,例如Amr RV222M,Amr RA121G,Amr RInsertion45,Amr RInsertion68,Amr RInsertion73,Amr RDeletion159-end,Amr RDeletion199-205,Pen AI139M,Pen AP145L,Pen AT147A和Pen AT264A,以及青霉素结合蛋白3（penicillin-binding protein 3,PBP3）的小片段缺失。结论:综上所述,本研究通过群体基因组学研究,揭示了海南类鼻疽伯克霍尔德菌的种群结构:包含5个主要种群和多个少数种群,表现出非常高的遗传多样性;其次,本研究明确了海南菌株的两个输入源头:泰国与新加坡,同时阐明了海南菌株的传播关系:不仅存在与周边国家和地区之间的相互传播,也存在海南本地不同城市之间频繁的相互传播;最后通过对毒力因子、耐药基因的研究,证实了海南菌株存在较高的致病能力与临床耐药潜在风险。上述研究结果加深了对海南岛类鼻疽伯克霍尔德菌遗传特征与致病机制的了解,也为针对该病原的监测、预防、控制、疫苗设计、临床治疗等各个方面提供了基因组数据和科学支撑。