枳壳为芸香科植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实,具有理气宽中、行滞消胀之功效,主治胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化等证,因生品燥性较强,临床常炮制后使用。江西作为枳壳道地产区,对于枳壳的炮制加工亦具有浓郁地方特色,常用饮片除2015版《中国药典》收载品种枳壳生品与麸炒枳壳外,尚有2008版《江西省中药饮片炮制规范》收载品种糠炒枳壳、“樟帮”特色饮片蜜麸枳壳、“建昌帮”特色饮片糠炒枳壳等。传统中医药理论认为枳壳经麸制、糠制后具有“减燥增效”的作用,但目前尚无对江西特色枳壳饮片炮制机制的研究报道,对药典法麸炒枳壳炮制机理的阐述也大多停留在该过程的两端,即化学成分和药理药效的变化层面,而对将这两方面有机关联的关键环节研究不够深入,并缺乏对药效作用进行必要的生物学功能验证,难以全面系统阐释枳壳作用机制和炮制内涵。为了解决上述问题,我们在本论文中进行了以下研究。1.目的采用现代成分分析检测技术,探究不同炮制方法对枳壳中化学成分变化的影响,并筛选枳壳优势饮片。采用药理学及分子生物学技术,明确枳壳“燥性”及“宽中除胀”作用的物质基础及作用机制,并在此基础上探讨枳壳炮制前后成分变化与药效差异的关联,以期最终阐释枳壳优势饮片品种的炮制机理。2.方法2.1江西特色枳壳不同炮制品物质基础研究以江西特色枳壳炮制品为研究对象,以枳壳生品及药典法麸炒枳壳作为对照进行研究。采用HPLC色谱法,测定枳壳不同炮制品中质量标志物（Q-Marker）橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷以及辛弗林含量;采用UHPLC-Q-TOF/MS色谱法结合Peakview软件的目标化合物匹配功能鉴定醇提液化学成分,并探究不同炮制方法对化学成分的影响;采用水蒸气蒸馏法提取挥发油及芳香水,通过GC-MS法检测挥发油及芳香水中挥发性成分种类及相对含量,并结合主成分分析统计方法比较枳壳挥发油及芳香水化学成分的差异,以及不同炮制方法对挥发性成分的变化的影响。此外,分别以Q-Marker成分含量及化学标记物色谱峰面积为指标,通过多指标加权评分的方法分别对不同炮制品种进行加权评分,综合分析并筛选出枳壳优势饮片品种。2.2枳壳“燥性”及麸制减燥机制研究建立慢传输型便秘（STC）以及胃黏膜损伤大鼠病理模型。以大鼠体质量、便秘指数、饮水量、排尿量、肾水通道蛋白3（AQP3）含量、血清环磷酸腺苷（cAMP）与血清环磷酸鸟苷（cGMP）比值为评价指标,观察不同剂量的枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳对健康大鼠水液代谢的影响;以胃黏膜损伤指数,血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素6（IL-6）,白细胞介素8（IL-8）含量为评价指标,观察各给药组对健康大鼠胃黏膜损伤的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应扩增仪（RT-PCR）检测各组大鼠胃窦和结肠组织中c-kit和SCF mRNA的表达水平。2.3枳壳“宽中除胀”作用及麸制增效机制研究建立功能性消化不良（FD）大鼠病理模型。以大鼠胃残留率和小肠推进率,血清胃动素（MTL）,血管活性肠肽（VIP）,降钙素基因相关肽（CGRP）含量为评价指标,观察不同剂量枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳对FD大鼠胃肠功能的影响;分别采用蛋白质免疫印迹（Western blot）与免疫组化（IHC）法检测下丘脑与胃窦中胃泌素（GAS）和生长抑素（SS）的蛋白表达水平与阳性细胞分布情况。2.4基于“物质基础-靶点-信号通路”关联的蜜麸枳壳炮制机理研究选取STC以及FD作为枳壳“燥性”和“宽中除胀”药效的疾病模型,并选择c-kit/SCF信号通路相关SCF、c-kit、PLC、RyR、IP3R蛋白作为STC疾病靶蛋白,GAS、SS作为FD疾病靶蛋白,采用网络药理学关联分析方法,通过活性分子筛选、靶点预测、分子对接、网络分析及通路分析,将枳壳生、制品中化学成分与相关靶蛋白进行分子对接,建立“物质基础-靶点-信号通路”网络,探讨蜜麸枳壳“减燥增效”的物质基础以及炮制机制。3.结果3.1江西特色枳壳不同炮制品物质基础研究枳壳经炮制后可不同程度增加橙皮苷含量,降低柚皮苷、辛弗林含量,而新橙皮苷含量经炮制后则未显示均一性变化趋势,蜜麸炒可使枳壳中新橙皮苷含量升高,而麸炒、蜜糠炒、糠炒则可不同程度降低新橙皮苷含量。将橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷及辛弗林含量作为指标进行综合加权评分后,发现枳壳炮制品中蜜麸枳壳综合评分最高。在枳壳不同炮制品的乙醇提取液中,共鉴定出了55种化学成分,经PLS-DA分析发现枳壳生、制品中共有14种具有显著性差异的化学标记物,将化学标记物峰面积作为指标进行综合加权评分后,发现以蜜麸枳壳综合评分最高。对枳壳挥发性成分进行检测后发现,D-柠檬烯和γ-松油烯为枳壳中最主要挥发性成分,而蜜麸枳壳中上述成分含量最高。挥发油与芳香水中化学成分存在明显差异,其中D-柠檬烯、γ-松油烯、芳樟醇、（1S）-（-）-α蒎烯、（1S）-（-）-β-蒎烯为挥发油和芳香水成分差异的化学标记物;不同炮制均会对挥发性成分产生一定影响,其中γ-松油烯、顺-Α,Α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、对伞花烃则为炮制前后的主要差异性成分。3.2枳壳“燥性”及麸制减燥机制研究在水液代谢方面,同等剂量给药组与空白组相比,差异性排序为枳壳生品>麸炒枳壳>蜜麸枳壳,且高剂量组>低剂量组;在胃黏膜损伤方面,不同剂量枳壳生品、麸炒枳壳、蜜麸枳壳组各项指标与空白组比较均无显著性差异。与空白组比较,生品枳壳组胃窦与结肠的c-kit和SCF mRNA表达均显著降低（P<0.01）;与模型组比较,生品枳壳高剂量组所有检测指标均无显著性差异;麸炒枳壳组、蜜麸枳壳组胃窦与结肠的c-kit和SCF mRNA表达有显著增加（P<0.05,P<0.01）。3.3枳壳“宽中除胀”作用及麸制增效机制研究在促胃肠动力方面,同等剂量给药组与模型组相比,差异性为蜜麸枳壳>麸炒枳壳>枳壳生品,且低剂量组>高剂量组。Western blot和IHC结果均显示模型组大鼠下丘脑和胃窦GAS表达较空白组显著降低（P<0.01）,SS表达较空白组显著增加（P<0.01）;各剂量给药组下丘脑和胃窦GAS、SS表达较之模型组均有不同程度上调和下调;与模型组比较,多潘立酮组下丘脑GAS、SS表达无显著性差异（P>0.05）,而胃窦GAS、SS表达则产生生显著上调和下调（P<0.01）。枳壳各炮制品中,均以蜜麸枳壳对于FD大鼠下丘脑和胃窦GAS、SS的调节作用最佳,且低剂量组调节作用优于高剂量组。3.4基于“物质基础-靶点-信号通路”关联的蜜麸枳壳炮制机理研究分子对接结果显示,枳壳中柚皮素、黄芩素-4’,7-二甲醚、5-羟基-6,7,8,4’-四甲氧基黄酮、2-甲基-5-（1-甲基乙基）-双环[3.1.0]-2-己烯、3-十二碳炔、D-柠檬烯、间伞花烃、（-）-芳樟醇等8种成分为枳壳燥性成分;圣草素-7-葡萄糖甙、柚皮素、柠檬苦素、闹米林酸、川陈皮素、闹米林、辛弗林、5-羟基-6,7,8,4’-四甲氧基黄酮、香风草苷、咖啡酸、（1R）-（+）-α蒎烯、3-十二碳炔、柠檬烯、间伞花烃、α-毕橙茄醇、（-）-芳樟醇等16种成分为枳壳“宽中除胀”药效活性成分。较之生品,蜜麸枳壳中有56.25%的药效活性成分含量升高,75%的燥性成分含量降低。4.结论枳壳经过炮制后,化学成分种类及含量均发生变化,且变化情况与炮制方法密切相关,且以“樟帮”特色蜜麸枳壳物质基础最优,故筛选其为最佳炮制品种进行后续研究。药效学研究发现,枳壳“燥性”主要表现为对机体津液的损伤,且强度与剂量有关,对健康大鼠胃黏膜未见明显直接刺激,麸炒枳壳与蜜麸枳壳均能有效缓和生品所产生的燥性效应,且蜜麸炒品炮制减燥作用优于麸炒品;枳壳生品和麸制品均可促进FD大鼠胃肠功能的恢复,且以蜜麸炒品促胃动力作用为佳。进而分析蜜麸枳壳“减燥增效”炮制机制,认为柚皮苷等8种燥性成分可作用正常大鼠胃肠道SCF、c-kit、PLC、RyR、IP3R蛋白,破坏SCF/c-kit信号通路,进而影响胃肠道Cajal间质细胞的数量和功能,从而导致口干、尿少、便秘等燥性体征,而经过蜜麸炒后有3/4燥性成分含量降低,可在一定程度上降低对c-kit和SCF蛋白表达的影响,达到缓和燥性的炮制目的。而经蜜麸炒后有超过半数药效成分含量升高,则可能是蜜麸枳壳增强“宽中除胀”作用的物质基础,圣草素-7-葡萄糖甙等16种药效成分可影响GAS蛋白与SS蛋白表达,而活性成分的升高,则可使药物调节FD大鼠外周胃肠激素GAS、SS的紊乱分泌的作用加强,增强药物作用。