甘蔗（Saccharum spp.hybrids）是最重要的糖类作物,甘蔗花叶病是一种世界性的甘蔗主要病害,影响甘蔗产量及含糖量。该病有多种病原,其中高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV）是近十多年来我国蔗区甘蔗花叶病的优势病原。有关该病的研究集中在病原菌分布情况、致病机制、检测方法以及通过沉默病毒蛋白基因改良抗病性的研究,但对甘蔗受花叶病毒侵染过程相关信号通路、差异表达基因与蛋白、互作基因与蛋白等还未深入研究。miRNA作为植物生长发育与抵御逆境的关键调节因子,能够通过调控靶基因的表达参与植物的各项生命活动。因此,本研究利用高通量测序和生物信息学技术,首次构建了甘蔗抗病和感病基因型受SrMV侵染后的miRNA富集文库;根据miRNA表达丰度的变化,鉴定SrMV诱导的差异表达miRNA及其靶基因;通过荧光定量PCR（qRT-PCR）及在本氏烟（Nicotiana tabacum）中瞬时过表达miRNA,验证差异表达miRNA的功能,揭示其在SrMV侵染下调控的分子机理,并进行抗病相关基因挖掘和鉴定,以期为利用基因工程技术创制抗病材料与培育抗花叶病品种提供抗病基因与靶点。主要研究结果与结论如下:1.以甘蔗品种ROC22（感病）和FN39（抗病）未携带病毒叶片与感染SrMV并显示花叶症状叶片为研究材料,利用Illumina HiSeq2500平台进行高通量测序,分析甘蔗响应SrMV侵染的miRNA表达谱变化,并以课题组前期测序获得的甘蔗响应SrMV侵染的转录组数据为参考库,对其靶基因进行预测。结果如下:（1）抗、感基因型及带病毒和不带病毒共12个样品测序后,共得到过滤后的序列（Clean Reads）161,145,158条,合计174.71 M数据量。运用miRDeep2软件,将所有Clean Reads与甘蔗转录组参考库进行比对,共预测到132个成熟miRNA,其中已知miRNA55个,新的miRNA 77个。在显著性差异表达（p值<0.01,Log2（FC）|≥1）的miRNA中,ROC22占19个,包含8个已知miRNA和11个新的miRNA,涉及16个上调表达及3个下调表达;FN39占30个,包含12个已知miRNA和18个新的miRNA,涉及17个上调表达及13个下调表达。（2）132个成熟miRNA共预测到靶基因1,037个,其中653个获得注释信息。在获得注释信息的显著差异表达miRNA的靶基因中,ROC22有29个,FN39有39个。对靶基因进行GO功能分析,结果表明:在两组样品中,有516个靶基因参与到40个GO功能分类项,其中ROC22显著差异表达miRNA的靶基因中有25个参与26个GO功能分类项,FN39显著差异表达的miRNA靶基因中有33个参与28个GO功能分类项,均主要富集在细胞成分（cellular component）、催化活性（catalytic activity）、代谢过程（metabolic process）、细胞过程（cellular process）和单生物过程（single-organism process）。KEGG通路注释分析显示,共有8个显著差异表达的miRNA靶向的7个靶基因涉及了 mRNA调控途径（mRNA surveillance pathway）等9个代谢通路。2.利用qRT-PCR技术,对筛选的12个显著差异表达的miRNA进行了表达量测序结果准确性验证。结果显示,12个显著差异表达的miRNA在2个甘蔗品种（ROC22和FN39）的16个测序结果（因有4个miRNAs在2个品种中均差异表达）中,有9个测序结果与定量结果相符,同为上调或同为下调表达。此外,对这12个miRNA及相应的15个靶基因在ROC22和FN39受SrMV侵染后的表达模式进行分析。结果显示:（1）在感病/抗病品种表达模式一致的8个miRNA中,有 6 个 miRNA（miR396a-5p、miR812f、miR1510b-5p、nov₉492、nov₉377和nov₂0472）在2个品种中均表现上调,2个miRNA（nov₃741和nov₄0875）在2个品种中均表现下调。且在这8个miRNA 中,有 5 个 miRNA（miR396a-5p、miR812f、miR1510b-5p、nov₉377和nov₂0472）及其靶基因在2个品种中均为负调控模式,2个miRNA（nov₃741和nov₄0875）及其靶基因为正调控模式,而nov₉492及其靶基因则在ROC22呈现正调控关系,在FN39中呈现负调控关系。（2）在感病/抗病品种表达模式不一致的4个miRNA（miR165a-3p、nov₂2650、nov₂8432 和 miR395b）,其表达模式均呈现为在ROC22中上调表达,在FN39中下调表达。其中,miR165a-3p和miR395b与对应靶基因的关系在2个品种中均表现为负调控;而nov₂2650和nov₂8432与对应靶基因的关系,在抗病基因型FN39中表现为负调控,而在感病基因型ROC22中则表现为正调控。3.以感染SrMV的ROC22叶片为模板,克隆得到3个显著差异表达的新型 miRNA（nov₃741、nov₂2650 和 nov₄0875）的前体序列。利用农杆菌介导的过表达技术,验证候选miRNA的功能。瞬时表达结果显示,3个miRNA均能引起本氏烟细胞内H2O2含量的增加,且qRT-PCR分析显示,过表达nov₃741能引起烟草过敏反应相关标记基因（NtHSR203和NtHSR515）、茉莉酸途径相关基因（NtPR-1a/c和NtPR2）和乙烯合成相关基因（NtEFE26和NtAccdeaminase）的上调表达,而过表达nov₂2650和nov₄0875则可引起过敏反应相关基因（NtHSR203和NtHSR515）和乙烯合成相关基因（NtEFE26和NtAccdeaminase）的上调表达。上述结果表明,nov₃741、nov₂2650和nov₄0875可能参与调控植物早期的免疫应答。此外,基于差异表达miRNA及其靶基因的表达调控模式,我们初步勾勒了甘蔗应答SrMV侵染的部分显著差异表达miRNA及其靶基因的调控网络图。4.从甘蔗响应花叶病毒侵染的转录组中,筛选得到一个差异表达的病程相关基因PR10（Pathogenesis-related gene 10）,命名为ScPR10（GenBank登录号:KT887884）。生物信息学分析结果显示,ScPR10蛋白包含PR10家族典型的“P-loop”基序和Bet_v 1-like结构域,且与斑茅（Erianthus arundinaceus）PR10 蛋白同源性高达 91.25%。qRT-PCR分析显示,ScPR10在蔗芽中表达量最高,其次为蔗皮、蔗肉以及蔗叶,而在根尖中几乎检测不到,表明ScPR10在甘蔗中为非组成型表达基因。ScPR10表达量分别在水杨酸和茉莉酸诱导后6 h和12h达到峰值,且在病原菌（黑穗病菌、SrMV）胁迫后,在抗病品种中表现上调,感病品种中表现下调。由此可见,ScPR10基因可以积极响应激素与生物胁迫。亚细胞定位表明ScPR10主要定位于细胞核。在本氏烟中过表达ScPR10后,可以增加细胞内H2O2含量,能够引起过敏反应相关基因（NtHSR201,NtHSR203和NtHSR515）以及茉莉酸相关基因（NtPR-1a/c,NtPR2和NtPR3）的上调表达,且能增强本氏烟对烟草青枯菌（Pseudomonas solanacearum）及烟草茄病镰刀菌蓝色变种（Fusarium solani var.coeruleum）的抗性。这些结果表明,ScPR10在甘蔗抗病防御中发挥潜在作用。