前言 腰腿痛是一种常见病，有研究表明，机械因素和炎症因素均参与了椎间盘退变。近年来，人们对白细胞介素(interleukin，IL)对软骨基质中蛋白多糖(proteoglycan，PG)代谢的影响进行了研究，有结果表明：小剂量的IL-1对软骨基质中PG的合成具有抑制作用，而较大剂量的IL-1对软骨基质中PG的降解具有刺激作用。说明IL-1在软骨基质的新陈代谢中起着重要的作用。IL-1有IL-α和IL-1β之分，已有报道表明IL-1α对椎间盘基质中PG降解存在着时间依赖性和剂量依赖性，而IL-1β对人椎间盘基质中PG代谢的影响还未见报道。本研究通过对胎儿椎间盘髓核的组织培养，探讨IL-1β对椎间盘基质中PG代谢的影响，以期进一步阐明腰椎间盘退变的原因。 实验材料 一、实验对象 取胎龄34周、自然流产的胎儿1具。在术后4h内无菌取出可见髓核的椎间盘，用直径为2mm的锐勺把髓核组织分成直径约2mm，高约1mm的组织块。 二、主要试剂 1．IL－la；IL－lp（Pepro tech EC Ltd公司） 2．D－Hanks液；． 3．smoUL的盐酸肌； 4．DMSO洗脱液（40％DMSO－0．05MgCI。）； 5．Trton－100； 6．Alcian液（Ician SGS chroma－gesellschd，Kongen，Gema－ny公司）； 7．DMEM－5叽 FBS培养液； 三、主要仪器 1．高速离心机； 2．96孔上色板； 3．37 T CO，培养箱； 4．EL800酶标仪（BIO－TEK UBSTRYNEBTS．INC） 实验方法 1．取胎龄34周，自然流产的胎儿1具。在术后4h内无菌取出椎间盘，用缓冲液冲洗干净，然后分离出髓核，浸于D－Hanks液中。用直径为Zmm的锐勺把髓核组织分成直径约Zmm，高约lmm的组织块。用 DMEM－5％FBS培养液冲洗 3次后，转移到培养瓶中，加人 25dDMEM－5％MS培养液。在 37℃、体积分数为5％的CO。培养箱中培养Zd。组织块在不含血清的DMEM液中冲洗3次。把组织块转移到每孔装有u…＊＊＊M培养液（不含血清）的96孔培养板中，备用。 2．不同浓度的 IL－la和 IL－lp对髓核中 PG代谢的影响 ：在 96 yL培养板中标出 42 IL，分成 6组，分别加人见一la和儿一lp 0．l、0．2＊．4nmoVL。放人 37℃、体积分数为 5％的 CO。培养箱中培养30h。分别测定加有不同浓度IL－la和IL－lp的培养 ·2·液中硫酸软骨素的含量。 3．IL－lp在不同培养时间对 PG代谢的影响：在 96孔培养板中标出36孔，分成3组，每组配成6对，并将每对中两孔随机分配为对照组和实验组，在实验组培养孔中加人 IL、－lp 0．3 nmoUL。在37℃、体积分数为5％的CO。培养箱中培养12上4＊2h。在不同时间测定培养液中硫酸软骨素的含量。 4．硫酸软骨素的检测方法 取待测样本 50…，加人 smoUL的盐酸狐 5041，静置 15min后，加人试剂1（高浓度的Alcian液万0…，振荡至完全溶解。然后加人试剂ZB（低浓度的Alcian液厂50…，在4T下孵育lh；12000r／min离心 15min，去除上清液；加人 DMSO洗脱液750pl，室温下搅拌30min；12000r／min离心 15min，去除上清液；加人溶解液500…，室温搅拌15min。在同一样品液中取240…相同的两份转移到96孔比色板中，630urn波长下测量样本中硫酸软骨素的含量。 实验结果 一＊L－la和 IL河 对髓核基质中 PG降解的影响 经 30h培养后发现，IL－la和 IL则 均可刺激 PG的降解。不同浓度组间硫酸软骨素浓度的差异有显著性：IL－la组（F＝8．383，P＜o．01）、IL－lP组（F＝9．9杆，P＜O．cd）。随着IL－la和 IL－lp浓度的增加，PG的降解有所增加，IL－la组中 0．4nmol／L组较其它三组硫酸软骨素浓度有显著性增高。IL－lp组中0．Zn。UL组较空白组对．4。oVL组较0．l刀．2。VL组硫酸软骨素浓度有显著性增高。表明 IL－la和 IL，堆以浓度依赖的方式促进椎间盘基质中PG的降解。 二、髓核基质中PG降解的时间依赖性 ·3· 在髓核组织培养液中加入 0．3nmoUL的 IL－lp，发现培养液中硫酸软骨素的浓度较对照组有显著性增加。经方差分析发现，每个时间段实验组和对照组的差异有非常显著性意义，随着培养时间的延长，培养液中硫酸软骨素浓度增加。经方差分析，12、24和72h每个时间段实验组与对照组间的差异亦有非常显著性意义（F＝7O．059，P＜o．01）。24、72h组均较12h组浓度增加，差异有非常显著性意义。72h组较24h组浓度有明显的增加，差异有非常显著性意义。证明几一lp可以通过时间依赖的方式促进椎间盘基质中PG的降解。 讨 论 有人报道在退变间盘中发现细胞因子，其中包括IL－l＊L－6JNF－a和单核巨噬细胞集落刺激因子，故推测这些炎症介质可能在椎间盘突出后的颈、腰神经根病的病理生理学发病机制上起重要作用。但是，这些细胞因子在椎间盘退?