第一部分非小细胞肺癌CT灌注参数与EGFR、MMP-9表达的相关性研究　　 研究背景和意义简介:　　 CT灌注作为一种无创、定量的检查方法，其评估肿瘤血管生成的价值在过去的20年中得到了广泛的认可。诸多研究表明几个CT灌注参数与肿瘤微血管密度及VEGF等基因的表达存在相关关系。但此类研究所选取的目的基因多数局限于VEGF，且采取免疫组化这一非定量手段作为基因表达程度的测定方法，不适合此类定量研究。　　 EGFR作为肿瘤细胞周期和血管生成的调控靶点，也是目前非小细胞肺癌分子靶向药物的治疗靶点。许多研究表明，其表达程度与肿瘤的生物学行为以及分子靶向药物的有效性关系密切，因而对肿瘤预后的评估及治疗方案的制定具有指导意义。但其表达程度的测定只能建立在手术获取肿瘤组织的基础上进行。另一方面，EGFR作为一个已知的血管生成因子，能够促进血管生成，其表达程度与VEGF表达程度也存在着相关性。因此，依赖EGFR的促血管生成作用，其表达程度就有可能与反映肿瘤血管生成情况的CT灌注参数建立关系。　　 MMP-9能够降解细胞外基质和基底膜，与肿瘤转移关系密切。另一方面，其破坏血管内皮完整性、改变血管通透性的作用已被之前研究证实。因此，依赖此作用，肿瘤组织增大的血管通透性就有可能被CT灌注参数PMB的改变所反映。　　 基于上述假设和存在的问题，我们选取之前研究未涉及的两个基因EGFR、MMP-9作为靶点，并采取之前此类研究未使用过的RT-PCR这一更为准确的方法作为基因表达程度的测定工具，定量分析这两个基因的表达程度与各灌注参数之间的相关关系。　　 目的:　　 建立CT灌注成像参数与非小细胞肺癌肿瘤组织EGFR、MMP-9表达量的相关模型，在此基础上探讨利用CT灌注这一无创手段评估肿瘤两个基因表达情况的价值。　　 材料和方法:　　 1.研究对象　　 从2012年6月至2013年3月，收集我院疑“肺占位”行胸部CT增强检查的患者，对其进行CT灌注扫描，并利用CT引导下穿刺术获取肿块组织样本，最后通过手术、病理、生化等检查确诊为非小细胞肺癌者共21例。其中男12例，女9例;年龄范围36～75岁，平均年龄59.81±11.39岁。另取10例肺部良性病变患者组织样本作为相对表达量测定的阴性对照，男7例，女3例;年龄范围30～73岁，平均年龄51.90±14.82岁。　　 2.CT灌注成像　　 采用西门子Somatom Definition双源CT(Germany);双筒高压注射器;非离子型对比剂碘海醇(350mgI/ml)注射液;后处理工作站CT workplace(Syngo2008G; Siemens Medical Solutions; Germany)。　　 首先对患者进行CT平扫。灌注层面在上述平扫所得图像的基础上进行选择;以平扫所见肿瘤最大层面为中心，采用轴扫方式进行多层连续动态增强扫描;若所选层面肿瘤坏死广泛，则酌情选取实性成份较多的邻近层面作为中心层面。曝光条件100kV，120mAs;旋转时间1s;层厚5mm;重建间隔5mm;z轴覆盖28.8mm;探测器宽度24mm×1.2mm;重建卷积核B30，FOV353mm。对比剂注射方案:采用双筒高压注射器注射碘海醇(350mgI/ml)，总量50ml，速率6ml/s;随后以6ml/s速率跟注60ml生理盐水。扫描于造影剂注射开始时延迟7s启动;采集次数31;采集间隔1s;采集总时间为31s，获取共155幅的图像序列。　　 灌注图像后处理待穿刺术后且得到明确的病理结果后进行，使用后处理工作站(CT workplace; Siemens)中的VPCT Body(Syngo2008G; Siemens MedicalSolutions; Germany)软件包进行分析。图像加载完毕之后，首先对图像进行运动校正。之后，手动剔除仍然无法校正或由于对比剂进入大血管而产生严重的星芒状伪影引起曲线较大波动的图像。ROI采取手动绘制，参照之前CT引导下穿刺CT图像，尽量选取取材区域位置的组织进行分析。软件计算生成ROI的BF、BV、TTP、PMB四个参数的伪彩图。记录各灌注参数数值，以及X线辐射剂量。　　 3.组织标本采集和贮存　　 本研究采用CT引导下经皮肺穿刺活检的方法对肿瘤组织进行取样，并进一步利用RNAlater溶液保存样品。采用西门子SOMATOM PLUS4 CT扫描仪;全自动活检穿刺抢(PAJUNK(R)，德国)，胸穿包，金属体表标记物;Eppendorf管、RNAlater溶液(Omega Bio-Tek，美国)。　　 术前完善患者临床检查，禁食4h。术者根据CT片显示病变的部位为患者选择相对舒适的体位。　　 首先对患者进行CT平扫，根据CT图像确定穿刺点、进针方向、角度及深度等。穿刺点消毒后，行局部麻醉至胸膜，在患者屏气时快速进针至病灶后再次对病灶扫描，以确定针尖在病灶内的位置，当穿刺针尖达到预定位置后切割取材。一般切割槽内可获得1.5～2.0cm×0.1cm大小的线头虫样组织标本。将标本浸入盛有RNAlater溶液的Eppendorf管中。并进一步移至-20℃条件下贮存。　　 4.RT-PCR测定基因相对表达量　　 取出组织标本，经过“组织总RNA抽提→去基因组→总RNA纯度和完整性检测→逆转录→定量PCR”几个步骤，用2-△△Ct法计算计算出每个肿瘤组织样本EGFR、MMP-9两个基因相对对照样本的相对表达量。反应条件:50℃2min;95℃2min;95℃15s，60℃32s读板，40 cycles;融解曲线分析:温度60℃-95℃。每个样品重复实验三次，结果取平均值。所使用的试剂和设备详见正文。　　 5.统计学分析　　 计量资料用均数±标准差((X)±S)表示。采用SPSS13.0版本对各组数据进行统计学分析。两样本间比较采用两独立样本t检验，两样本非正态分布时采用Mann-Whitney U检验（正态性检验采用单样本K-S拟合优度检验，方差齐性检验采用Levenes检验），两个率的比较采用x2检验;肺癌CT灌注参数BF、BV、TTP、PMB与EGFRmRNA、MMP-9 mRNA的相对表达量(2-△△Ct)之间的相关分析采用Pearsons相关性检验，双变量不满足正态分布者采用Spearman相关性检验。P＜0.05认为差异存在统计学意义。　　 结果:　　 1.临床资料统计　　 21例肿瘤标本经病理检查均为NSCLC，其中鳞癌7例，腺癌13例，大细胞癌1例;10例肺部良性病变患者中，7例慢性炎症，2例为充血水肿的肺组织伴轻度纤维增生，1例为炎性假瘤。肺癌组与对照组之间性别(x2=0.472，P=0.492)、年龄(t=-1.640，P=0.112)无统计学差异。　　 （注:对照组不参与的相关分析，仅作为RT-PCR计算相对表达量的阴性对照）　　 2.CT检查X线辐射剂量　　 21例受检者CT灌注扫描的平均DLP为418.0mGy*cm，胸部平扫平均DLP为513.9mGy*cm，平均总DLP为1421.6mGy*cm;与常规检查相比，本研究所采用的灌注扫描方案辐射剂量为胸部平扫剂量的0.81倍，占检查总剂量的29.4％。　　 3.EGFR、MMP-9 mRNA表达情况　　 肺癌组EGFR mRNA表达显著高于对照组(Z=-2.747，P=0.006)，高表达者占肺癌组总数的76.19％;肺癌组MMP-9 mRNA表达显著高于对照组(Z=-2.197，P=0.028)，高表达者占66.67％。　　 4.各灌注参数与EGFR、MMP-9表达量相关性　　 相关分析示:BF(r=0.213，P=0.353)、BV(r=0.403，P=0.070)、PMB(r=0.153，P=0.507)与EGFR表达无显著相关性，但存在不同程度的相关趋势，以BV最为明显;TTP与EGFR表达无显著相关性，相关趋势亦不明显(r=0.035，P=0.881)。PMB与MMP-9表达存在显著相关(r=0.474，P=0.030); BF(r=0.227，P=0.323)、BV(r=0.272，P=0.233)与MMP-9表达相关性不显著，但存在相关趋势;TTP与MMP-9表达无显著相关性及相关趋势(r=-0.004，P=0.987)。　　 结论:　　 1.NSCLC病人肿瘤组织EGFR的表达程度与CT灌注参数BF、BV之间相关性不显著，但存在相关趋势，推测其原因可能由于EGFR影响了肿瘤血管生成，并在一定程度上由代表血流量和血容量的参数BF、BV所反映，但此作用尚不够显著以构成统计学意义。　　 2.与BF相比，BV与肿瘤组织EGFR表达的相关趋势更高，提示EGFR调节肿瘤血管生成的诱导作用可能更多体现在改变血管形态这一方面。　　 3.NSCLC病人肿瘤组织MMP-9的表达程度与CT灌注参数PMB之间存在显著正相关，这可能是由于MMP-9升高了血管内皮细胞的通透性并促进了肿瘤微血管基底膜的降解，使得血管内皮完整性降低，而最终导致代表血管通透性的参数PMB升高。　　 第二部分非小细胞肺癌CT灌注参数与EGFR基因突变的关系　　 研究背景和意义简介　　 EGFR基因酪氨酸激酶功能区18-21号外显子的突变是目前世界范围内公认的非小细胞肺癌分子靶向药物治疗有效的前提，在临床工作中被广泛应用于分子靶向药物治疗有效群体的筛查。而目前突变的检测有赖于手术获取肿瘤标本。与野生型相比，突变型肿瘤EGFR活性增强，而作为促血管生成因子，之前研究证实EGFR的活性增强可导致VEGF表达和活性上调，进一步可促进肿瘤血管生成。　　 近几年已有几项关于EGFR突变型与野生型肿瘤影像学差异的研究，如两种类型肿瘤CT平扫征象差别的分析(发表于Radiology)和PET/CT标准摄取值的差异，但目前尚无关于CT灌注方面的研究。　　 CT灌注作为一种无创、定量的检查方法，其评估肿瘤血管生成的价值在过去的20年中得到了广泛的认可。诸多研究表明几个CT灌注参数与肿瘤微血管密度及VEGF等基因的表达存在相关关系。那么，EGFR突变型与野生型肿瘤在血管生成方面的差异是否能够被CT灌注参数无创的检测到呢？如果可以，那么CT灌注参数是否可以进一步作为EGFR存在突变与否的预测指标呢？基于此假设，我们开展了本项研究。　　 目的:　　 通过比较EGFR突变型与野生型非小细胞肺癌病人的CT灌注参数之间的差别，以达到利用CT灌注参数为判断EGFR突变情况提供帮助的目的。　　 材料和方法:　　 1.研究对象　　 研究对象的一般资料、纳入标准和排除标准同第一部分。研究对象分组:根据病人肺癌组织EGFR基因的18、19、20、21号4个外显子之一是否存在突变，将21例肺癌病人分为EGFR突变型组和EGFR野生型组。其中突变型组共9例，男4例，女5例;年龄范围36～75岁，平均年龄57.44±12.63岁;野生型组12例，男8例，女4例;年龄范围43～73岁，平均年龄61.58±10.57岁。　　 2.CT灌注成像:　　 利用CT灌注成像获得肿瘤的BV、BF、TTP、PMB四个参数，具体方法步骤同第一部分。　　 3.组织标本采集和贮存　　 本研究采用CT引导下经皮肺穿刺活检的方法对肿瘤组织进行取样，取出的组织样品浸入10％甲醛固定液内，具体方法步骤详见第一部分。浸泡于甲醛固定液中的组织进一步进行石蜡包埋，制作石蜡切片。　　 4.EGFR基因突变检测(PCR荧光探针法)　　 本研究样本取材后，由我院病理科制作石蜡组织切片，并交送我校**省分子肿瘤病理重点实验室进行EGFR突变检测。仪器和器材详见正文，主要步骤包括“石蜡组织DNA提取→EGFR基因荧光检测→检测结果判定”。　　 本研究使用人EGFR基因突变检测试剂盒(Human EGFR mutation detectionkit)吉菲源（上海源奇生物医药科技有限公司），采用PCR体外扩增的方法以及实时荧光Taqman探针法，通过荧光信号的变化来检测标本中EGFR(exon18)、EGFR(exon19)、EGFR(exon20)、EGFR(exon21)突变情况。根据标本内参基因Ct值＜38或≥38来分情况判断，详见正文。　　 5.统计学分析:　　 计量资料用均数±标准差((X)±S)表示。采用SPSS13.0版本对各组数据进行统计学分析。两样本间比较采用两独立样本t检验，两样本非正态分布或方差不齐时采用Mann-WhitneyU检验（正态性检验采用单样本K-S拟合优度检验，方差齐性检验采用Levenes检验），对存在统计学差异的灌注参数进一步作ROC曲线以评价其预测EGFR突变的判别效果，两个率的比较采用x2检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1.临床资料统计　　 EGFR突变型组9例，在本研究中突变发生率为42.9％;其中exon18、exon19、exon20、exon21四个外显子的突变例数分别为0、5、1、4（其中一例同时存在exon19、exon20两个位点的突变）;肿瘤标本经病理检查，鳞癌2例，腺癌7例。EGFR野生型组12例中鳞癌5例，腺癌6例，大细胞癌1例。两组组之间性别(x2=1.037，P=0.309)、年龄(Z=-0.712，P=0.476)无统计学差异。　　 2.EGFR突变型组与EGFR野生型组间灌注参数的比较　　 EGFR突变型组的四个灌注参数BF(t=1.939，P=0.070)、BV(t=1.567，P=0.134)、TTP(t=0.106，P=0.917)、PMB(t=1.146，P=0.266)均高于野生型组，且BF、BV之间的差别较明显，各参数组间差异均无统计学差异。　　 3.灌注参数预测EGFR突变的ROC曲线分析　　 ROC曲线分析中，我们选取灌注参数BF、BV和PMB来预测EGFR的突变情况。ROC曲线下面积分别为BF:0.741(95％ CI:0.516-0.966，P=0.065，SE=0.115)、BV:0.648(95％ CI:0.401-0.895,P=0.256, SE=0.126)、PMB:0.583(95％CI:0.329-0.838，P=0.522，SE=0.130)，三者预测均不具有统计学意义。当BF取值32.475时，其预测EGFR突变的灵敏度为88.9％，特异度为77.7％，约登指数为0.556，达到最大值。　　 结论:　　 1.EGFR突变型NSCLC病人灌注参数BF、BV较野生型者高，可能系突变导致EGFR活性增强，进一步导致VEGF产生增多并血管生成增多，而致使代表血流量、血容量的参数BF、BV升高，但此过程可能尚不够显著以构成统计学差异。　　 2.NSCLC病人的BF、BV、PMB指标尚不足以作为预测EGFR突变状态的可靠依据，但在无法通过手术获取组织标本的情况下，灌注参数可为EGFR突变与否的判断提供辅助信息。