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背景和目的:下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG)的完整和功能正常是维持机体青春期发育与正常生殖功能的关键。其中,下丘脑Kiss-1神经元合成的kisspeptin可通过与其特异受体GPR54结合而直接作用于下丘脑Gn RH神经元,促进Gn RH的分泌并升高血清LH和FSH水平,从而激活并维持HPG轴功能。Kiss-1/GPR54基因突变可导致低促性腺激素性性功能减退,出现青春期发育异常、性腺功能减退和不孕不育。因此,Kiss-1/GPR54是调节HPG轴及生殖功能的关键,近年研究还提示kisspeptin可能直接或间接地参与了机体肥胖、糖尿病等代谢紊乱过程。此外,甲状腺激素与生殖系统功能的关系也十分密切,甲亢或甲减患者常会出现不同程度的生殖功能异常。关于甲状腺激素对生殖功能的影响研究多集中在甲状腺激素直接对外周睾丸或卵巢功能的影响,然而现有结论并不能解释所有的临床现象,越来越多的证据提示甲状腺激素也可以通过中枢途径影响哺乳动物的生殖功能。综上,本研究在前期发现甲减大鼠下丘脑kisspeptin表达降低及小鼠侧脑室慢性注射T3可通过作用于下丘脑Kiss-1神经元影响HPG轴并引起小鼠摄食量增加的基础上,旨在通过构建下丘脑Kiss-1神经元特异性TRβ基因敲除小鼠并观察其生殖表型及代谢表型的改变情况,来探讨甲状腺激素是否通过与下丘脑Kiss-1神经元上的TRβ作用影响生殖功能从而发挥其通过中枢途径对生殖功能的影响和调控以及是否会引起代谢功能改变,这对阐明HPT轴与HPG轴及代谢功能之间的联系和相互作用具有重要意义,可能为甲状腺疾病相关的生殖疾病及一些代谢疾病的防治提供新的理论基础和为治疗相关的生殖或代谢疾病寻找新的作用靶点。方法:本研究利用CRISPR/Cas9技术原理和Cre-Lox P系统构建Kiss-1神经元特异性TRβ基因敲除小鼠模型,通过检测基因敲除组和对照组小鼠出生后体重、摄食饮水量、阴道开放时间、动情周期节律性、生育能力、葡萄糖耐量与胰岛素耐量及FSH、LH、E2、T和AMH激素水平等指标来分析小鼠Kiss-1 TRβ基因敲除后生殖、代谢表型的改变情况。结果:1.生殖表型结果:(1)Kiss1-TRβKO组雌鼠青春期启动阴道打开的年龄(33.500±0.627日龄,n=8)与对照组(32.833±0.401日龄,n=6)相比未见明显差异;2月龄雌鼠Kiss1-TRβKO组血清FSH水平较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),同时,KO组血清LH、E2水平较对照组亦有所下降,并且KO组8只雌鼠中有3只出现紊乱的动情周期,而对照组6只雌鼠均可见规律、完整的动情周期,两组动情周期节律性差异明显,然而差异无统计学意义;2月龄雌鼠血清AMH水平在Kiss1-TRβKO组与对照组之间未见明显差异,随着年龄增长,6月龄雌鼠无论是KO组或对照组相较于2月龄雌鼠的KO组或对照组血清AMH水平均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),并且6月龄雌鼠KO组血清AMH水平较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);无论Kiss1-TRβKO组雌鼠或对照组雌鼠与野生型C57BL/6J雄鼠配对后均可受孕(受孕率均为100%),KO组雌鼠的产仔均数(6.250±0.590个)少于对照组雌鼠(7.833±0.477),但差异无统计学意义。(2)随着年龄的增长,6月龄雄鼠Kiss1-TRβKO组或对照组的血清FSH水平相较于2月龄雄鼠的KO组或对照组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),而KO组与对照组之间的血清FSH水平在2月龄或6月龄时均未见明显差异;6月龄雄鼠Kiss1-TRβKO组血清LH水平相较于2月龄雄鼠KO组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),6月龄雄鼠对照组血清LH水平相较于2月龄雄鼠的对照组亦明显下降,而KO组与对照组之间的血清LH水平在2月龄或6月龄时均未见明显差异;值得注意的是,2月龄雄鼠血清T水平在Kiss1-TRβKO组与对照组之间未见明显差异,随着年龄增长,6月龄雄鼠无论是KO组或对照组相较于2月龄雄鼠的KO组或对照组血清T水平均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),并且6月龄雄鼠KO组血清T水平较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);无论Kiss1-TRβKO组雄鼠或对照组雄鼠均可使野生型C57BL/6J雌鼠受孕(受孕率均为100%),KO组产仔均数(7.250±0.750个)与对照组(7.250±0.881)相比未见明显差异。2.代谢表型结果:与对照组相比,Kiss1-TRβKO组雄鼠在离乳后第1、2周摄食、饮水量明显增多(P<0.05),但在离乳后第3、4、5周其摄食、饮水量即恢复正常,KO组雌鼠离乳后第1-5周的摄食、饮水都表现正常,此外,KO组雌或雄鼠的体重、糖耐量和胰岛素耐量与对照组相比均无明显差异。结论:1.本实验结果提示,甲状腺激素与下丘脑Kiss-1神经元TRβ相互作用参与了下丘脑维持HPG轴稳定性及机体维持卵巢储备功能的调节,为甲状腺激素通过中枢途径调节机体生殖功能提供了一个新的研究思路和研究靶点。2.实验结果提示Kiss-1神经元TRβ基因敲除对小鼠代谢表型无显著影响,有助于我们确定下一步的研究方向和研究计划。3.本实验只选择性地敲除了Kiss-1神经元TRβ基因而未能敲除Kiss-1神经元TRα基因,故尚不能排除甲状腺激素主要通过与下丘脑Kiss-1神经元TRα作用而发挥中枢调节生殖功能的可能,必要时可进一步研究甲状腺激素与Kiss-1神经元TRα的关系,以进一步探讨甲状腺激素通过中枢途径调节生殖功能及HPT轴与HPG轴之间可能存在的其它联系和相互作用。