鼻咽部微生物区系是动物体内微生态系统的组成部分,在呼吸系统正常功能中有重要作用。其中溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体等是机会致病菌,当机体遭遇运输、混群、过度拥挤、天气变化等外界应激因素时,机体免疫力降低,细菌大量繁殖,导致呼吸道感染。牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）是包括牛船运热、支气管炎在内的多种呼吸系统疾病的总称,给畜牧业造成严重的经济损失。BRDC可由多种细菌引起,多杀性巴氏杆菌被认为是关键致病菌之一。多杀性巴氏杆菌引起的BRDC中最常见的是A型多杀性巴氏杆菌。随着近几年基因组学快速兴起,对多杀性巴氏杆菌分离株毒力差异的研究取得显著进展,很多毒力因子陆续被发现,包括皮肤坏死毒素、铁捕获蛋白、荚膜以及多种外膜蛋白,但人们对多杀性巴氏杆菌的致病机制仍知之甚少。本研究首先分析了有呼吸道症状牛的鼻咽微生物区系组成与分布,然后对分离到的牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株PMPAN001和弱毒株PMPAN007通过二代测序技术进行全基因组测序,进行比较基因组学分析,研究不同毒力菌株基因功能的差异,分析毒力分化的可能原因;进一步比较了牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株PMPAN001与弱毒株PMPAN007在小鼠脏器细菌载量、毒力基因体内外转录水平和肺组织损伤等方面的差异,探究了强弱毒株致病机制的区别,并尝试构建多杀性巴氏杆菌缺失株。通过上述研究以期为A型多杀性巴氏杆菌致病机理研究提供参考资料和依据。1.16S rRNA高通量测序检测奶牛呼吸道微生物群落结构及多样性通过16S rRNA高通量测序技术评估有呼吸道疾病症状的后备牛和泌乳牛上呼吸道的微生物区系区别。采集养殖场14头后备牛和37头泌乳牛鼻咽深拭子样本进行微生物多样性分析,发现优势菌群是变形杆菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。Alpha多样性分析表明后备牛鼻咽部物种多样性显著高于泌乳牛,且在门水平上,后备牛鼻咽微生物区系中变形杆菌门显著高于泌乳牛,在属水平上,泌乳牛鼻咽微生物区系中莫氏杆菌属、醋杆菌属细菌显著高于后备牛。本研究为牛场呼吸道疾病的防控提供了基础资料。2.多杀性巴氏杆菌强弱毒株比较基因组学分析对牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株PMPAN001与弱毒株PMPAN007进行比较基因组学分析。PMPAN001和PMPAN007基因组虽然高度相似,但也存在明显的不同。与PMPAN007相比,PMPAN001在1640kb～1800kb区段存在大片段缺失。另外,在同源分析的基础上,本试验发现强毒株PMPAN001中基因岛以及包含的基因数量多于PMPAN007的2倍。与PMAPN007相比,PMPAN001还存在很多特有基因可能在致病过程中起重要作用,包括ISAac3、ISKpn25、IS1016C2和ISRso21以及毒力相关基因 flpC、fles、narH等。3.多杀性巴氏杆菌强弱毒株体内外毒力相关基因表达差异的研究比较研究了 A型多杀性巴氏杆菌强毒株PMPAN001与弱毒株PMPAN007在动物脏器细菌载量、共有毒力基因体内外转录水平和肺组织损伤等方面的差异。PMPAN001在体内的增殖水平远高于PMPAN007。另外,相同毒力基因在强弱毒株中的转录水平也不同。在体外毒力相关基因的转录水平也不能反映在体内的真实情况。研究表明强毒株中高转录的毒力相关基因imA、exbD、fur、oma87、pmHAS和tonB可作为评价多杀性巴氏杆菌毒力的可能标志物。与PMPAN007相比,PMPAN001的29个特有毒力基因中,8个在体内表达,且多数与细菌黏附有关,推测这部分基因在小鼠致病过程中起重要作用。4.多杀性巴氏杆菌基因突变载体的构建PCR扩增PMPAN001株基因flpC、LH0147、fbpA和flpD的上下游同源臂,然后通过融合PCR将来自pUC-4K的卡那霉素抗性基因盒插入靶基因上下游同源臂之间,最后将三段融合片段克隆至质粒pBC-SK,构建4个重组自杀性质粒:pBC-SK-flpC、pBC-SK-LH0147、pBC-SK-fbpA、pBC-SK-flpD,利用电转将其导入感受态 PMPAN001细胞,多次摸索电转条件后,转化后在抗性平板上生长的菌落均为阴性,未能筛选到正确的基因敲除株。本研究对构建P.multocida突变株的条件进行了探求,为进一步构建P.multocida缺失株奠定了基础。