研究背景:毒品滥用是全球各国都面临的棘手的社会问题,特别是新型毒品种类不断增多,为毒品的防治提出新的挑战。我国的吸毒问题也日趋严峻,长期吸毒往往会造成吸毒者机体和精神两方面的损害,并能传播艾滋病、肝炎等多种疾病,严重影响个体身心健康。吸毒成瘾者为筹措毒资所引发的刑事犯罪案件和社会治安事件也日益增多,对社会的稳定造成极大危害。近年来,国际上关于新型毒品成瘾及损伤机制方面的研究,已成为热点课题。　　 甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)属于苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-type stimulants,ATS),又称去氧麻黄素。近年来,METH的滥用人数不断上升,全球滥用仅次于大麻,成为危害最为严重和广泛的毒品之一。METH具有多种药理、毒理学特性,特别是有很强的中枢兴奋作用且易形成药物依赖性,长期滥用可以引起中枢神经系统神经化学、神经病理和行为的改变。对METH成瘾者而言,毒品影响的不仅是精神,还包括神经结构和功能的损伤性改变。近年来的研究显示,METH有较强的神经毒性,可导致大脑出现与阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)和帕金森病(Parkinsons disease,PD)等神经退行性病变类似的病理学改变。现阶段的研究结果显示,这些可能的机制主要包括:氧化应激损伤作用、体温平衡失调、离子稳态破坏以及细胞凋亡相关通路的激活等。但现有的研究结果仍不足以充分阐释METH的神经毒性机制,对其毒性作用尚缺乏有效的防治手段。　　 我们在前一阶段的研究中,对METH注射后大鼠额叶皮质、纹状体、海马等部位的差异表达蛋白质进行鉴定和分析,认为氧化应激、能量代谢障碍、蛋白酶体功能失调以及凋亡等是参与METH神经毒性的主要机制。其中,一种新型的一氧化氮(nitric oxide,NO)生成调节酶——二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(Nω,Nω-dimethyl—L-arginine dimethylaminohydrolase,DDAH1)在纹状体和额叶皮质的高表达尤其令人瞩目。DDAH是近年发现的一种蛋白酶,在体内存在生物学活性相似的两种亚型,其中DDAH1主要分布于中枢神经系统。DDAH主要参与不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylated L-arginine,ADMA)的分解代谢,体内95％以上的ADMA均由DDAH分解代谢,使正常生理情况下不同的组织器官内的ADMA浓度维持在相应的水平。而ADMA是含有甲基化精氨酸蛋白质的分解产物,蛋白质甲基化是生物体内普遍存在的一种蛋白质翻译后修饰现象,蛋白质的甲基化和甲基化蛋白质的降解,是机体内存在的正常生理过程。研究发现,ADMA是内源性的一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase,NOS)的抑制剂,对三种亚型的NOS均有抑制作用。某种病理情况下体内ADMA浓度下降,则可导致其对NOS的抑制作用减弱,组织内NO合成增加。可见,DDAH可以通过调节组织内ADMA的降解率,调节组织中NOS的活性和NO的合成。正常生理条下,中枢神经系统中的NO主要通过神经型NOS(nitric oxide synthase,nNOS)产生,作为神经递质发挥生理作用并可调节神经轴突的可塑性。而在氧化应激等病理条件下,产生的过量NO,则有可能对组织造成损害。研究证明,氧化应激及其过程中产生的NO,在衰老和AD等多种神经退行性疾病的发病机制中起重要作用,NO和超氧阴离子的产物可造成脑组织DNA、蛋白质和脂质氧化损伤而诱导神经细胞损伤、功能丧失和死亡。　　 越来越多的研究结果提示DDAH/ADMA/NOS系统可能是NO过表达引起的中枢神经系统损伤病理过程的重要调控机制。根据我们上一阶段的研究结果,METH导致DDAH1在额叶皮质和纹状体表达增高,这些部位脑组织同时伴有NO的升高和神经组织损伤,表明METH有可能通过DDAH/ADMA/NOS系统调控NO的合成产生相关的神经毒性作用。目前,中枢神经系统中nNOS的调控机制尚未明了,研究DDAH/ADMA/NOS系统在METH神经毒性机制中的作用,将为METH毒性的防治和其他相关神经退行性疾病的治疗提供新的思路和有效的药物作用靶点。　　 目的:建立单纯METH急性中毒和经L-257预处理的METH急性中毒动物模型,运用病理学、行为学、神经化学、细胞生物学等方法,了解METH毒性作用及L-257预处理对METH毒性作用的影响；检测L-257预处理大鼠脑组织中与METH毒性作用密切相关的氧化应激DDAH1/ADMA/NOS信号通路分子的表达变化,探讨DDAH1特异性抑制剂L-257是否能通过降低组织中DDAH1的含量及酶的活性,而减轻METH的神经毒性损伤。　　 方法　　 1.单纯METH急性中毒和经L-257预处理的METH急性中毒动物模型的建立成年雄性SD大鼠,体重180～220g,随机分为①单纯METH组(A组)；②经L-257预处理的METH组(B组)；③生理盐水组(C组),每组20只。动物单只单笼饲养于空调恒温动物房,自由饮水进食,24小时正常昼夜节律,饲养适应一周后开始实验。　　 1.1.单纯METH急性中毒动物模型的建立A组动物腹腔注射METH,剂量为15mg/kg体重,每天早8:00点、晚6:00点各注射一次,连续注射4天,共8次。注射后出现神经毒性相关症状视为模型成功。　　 1.2.L-257预处理的METH急性中毒动物模型的建立B组动物实验前一周进行侧脑室插管手术。实验开始后每天早8:00点、晚6:00点经插管向侧脑室内注射L-257一次,剂量为15mg/kg体重,连续注射4天,共8次。每次注射后间隔二小时腹腔注射METH,剂量为15 mg/kg体重,亦为连续注射4天,共8次。动物对手术及侧脑室内留置管耐受良好,无异常反应,给予METH后出现与A组相似的神经毒性表现视为模型成功。　　 1.3.生理盐水组的建立C组设为正常对照组,每天早8:00点、晚6:00点各腹腔注射一次生理盐水,剂量为0.6ml,连续注射4天,共8次。　　 以上所有动物实验前均驯养一周。每日训练一次,每次1～5min,使大鼠习惯术者以后对其触摸及进行各种操作。　　 2.吸毒动物的行为学及病理学观察每天早上给药前记录各组大鼠体重、进食量、饮水量的变化,给药后10min观察动物的刻板行为改变并评分,末次腹腔注射后24h断头取脑组织进行HE染色、Gless氏银浸染观察脑组织病理变化,并用TUNEL法进行神经细胞凋亡的检测。　　 3.单纯METH中毒动物模型脑组织DDAH1/ADMA/NOS系统表达变化、相关因素的检测各组动物末次腹腔注射后24h断头取脑,参照大鼠脑立体定位图谱,分离纹状体、海马、额叶皮质等三个脑区组织,采用逆转录实时定量PCR、Western Bolt方法检测DDAH1在基因和蛋白水平的表达；ELISA法检测ADMA含量；酶化学法检测细胞nNOS活性、NO含量。　　 4.经L-257预处理的METH急性中毒动物脑组织中DDAH1/ADMA/NOS系统表达变化、相关因素的水平检测和作用分析:方法同3。　　 结果　　 1.单纯METH急性中毒动物模型和经L-257预处理的METH急性中毒动物模型建模成功　　 1.1.METH急性中毒动物模型建模成功METH注射后,A组动物进食量减少,体重下降,同时出现明显的行为改变,主要表现为好动、易激惹等。与C组相比上述指标差异均有显著性差异(P<0.05)。　　 1.2.L-257预处理的METH急性中毒动物模型建模成功B组动物在METH注射后进食量显著减少,体重下降,同时出现明显的行为改变,上述检测指标与A组相比无显著性差异。与C组相比,B组动物上述指标差异均有显著性差异(P<0.05)。　　 2.单纯METH急性中毒动物和L-257预处理METH急性中毒动物脑组织的形态学改变　　 2.1.单纯METH急性中毒动物脑组织的形态学改变A组动物腹腔注射METH后,额叶皮质、纹状体、海马等部位神经细胞均出现细胞变圆,极性消失,细胞周围水肿等形态学改变。Gless氏银浸染发现,A组动物三个脑区神经轴索均呈现出扭曲、蛇行状,有节段性增粗和轴索间隙增宽的表现,且凋亡细胞比例明显增多。　　 2.2.经L-257预处理的METH急性中毒动物脑组织的形态学改变B组动物在给予L-257后神经细胞及轴索也出现与A组类似的改变,但与A组相比,程度明显减轻。　　 3.单纯METH急性中毒动物脑组织中DDAH1/ADMA/NOS系统表达变化、相关因素的检测在额叶皮质和纹状体,A组动物DDAH1基因表达上调,蛋白表达相应增加,ADMA含量下降,与C组相比有显著性差异(P<0.05)；在海马区,METH并不影响DDAH1基因和蛋白的表达,A组与C组相比无显著性差异(P>0.05)。A、B组三个检测脑区总NOS活性及NO的含量均显著高于C组(P<0.05)。　　 4.经L-257预处理的METH急性中毒动物脑组织中DDAH1/ADMA/NOS系统表达变化、相关因素的检测B组三个检测脑区DDAH1基因及蛋白的表达显著低于A组(P<0.05),同时ADMA含量较A组显著升高(P<0.05),NOS活性及NO的含量均显著低于A组(P<0.05),但尚未达到C组水平,B组与C组比较,有显著性差异(P<0.05)。　　 结论:　　 1.单纯METH急性中毒组动物出现明显的METH所致神经毒性表现,说明METH急性中毒动物模型建立成功。　　 2.L-257预处理的METH急性中毒动物模型建立后大鼠对脑室内插管耐受好,表现出与单纯METH急性中毒动物相似的病理和行为学改变,说明L-257预处理的METH急性中毒动物模型建立成功。　　 3.METH具有明显的神经毒性作用,可造成大鼠额叶皮质、纹状体、海马等多脑区神经细胞和轴索的损伤,引起细胞凋亡,中毒动物出现明显的行为改变。　　 4.经过对METH急性中毒动物DDAH1/ADMA/NOS的观察和相关因素的检测,发现METH导致脑组织中DDAH1的含量增加、ADMA浓度降低,脑组织NOS活性增高,以及NO的过量生成。认为DDAH1/ADMA/NOS系统的上述改变,是METH神经毒性作用的重要机制之一。　　 5.DDAH1的特异性抑制剂L-257可以通过降低DDAH1的含量、提高脑组织中ADMA的浓度,使NOS活性增高,阻止NO的过量生成从而部分减轻氧化应激过程中METH的神经毒性。