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背景:抗生素相关性腹泻（AAD）是一种存在于接受了抗生素治疗患者群体中的常见并发症,其发病率在5-35%之间,且随抗生素的升级换代发病率成增加的趋势。抗生素相关性腹泻不仅严重阻碍了疾病的恢复,而且会威胁生命。虽然抗生素相关性腹泻的发病机制仍在研究中,但目前认为是抗生素进入肠道破坏肠道微生物菌群,导致继发性的致病菌定殖和增殖。因此,调节肠道微生物菌群是预防和治疗AAD的主要手段之一。香连丸是一种治疗痢疾的传统经典名方,其源自于《太平惠民和剂局方》,广泛用于治疗湿热痢疾等胃肠道疾病,其药理作用主要有抗菌、抗炎、镇痛等。然而,关于香连丸对抗生素相关性腹泻的治疗,特别是对肠道微生物菌群及其代谢产物的影响,目前尚未见报道。因此在这篇论文中,我们探究了香连丸治疗抗生素相关性腹泻的效果,并对相关机制进行了初步研究。目的:阐明香连丸治疗抗生素相关腹泻的效果及可能的机制,明确其发挥作用的有效成分,为扩大香连丸的临床应用提供理论依据,同时,构建一种持续稳定的AAD小鼠模型。方法:1.抗生素相关性腹泻动物模型的构建首先,以KM小鼠为实验对象,灌胃不同剂量的抗生素,各抗生素按约临床剂量的8倍,灌胃2次/d,连续5d;停止抗生素后,再观察8d;对小鼠的活动情况、饮食/饮水量、体重,根据腹泻评分标准进行腹泻程度评估。其次,根据单用抗生素的结果,选取致腹泻较明显的药物进行组合:头孢拉定（1.00g/kg）+庆大霉素组（0.16g/kg）,头孢呋辛（0.26g/kg）+左氧氟沙星组（0.20g/kg）,头孢克肟（0.10g/kg）+罗红霉素组（0.08g/kg）,灌胃2次/d,连续5d,并根据腹泻评分标准进行腹泻程度评估。最终,选择头孢呋辛+左氧氟沙星模型,对该模型小鼠采用16S r DNA测序技术分析肠道菌群变化;HE染色观察肠道结构受损情况;Western Blot检测结肠组织中紧密连接蛋白Occludin,Claudin-1的表达变化。2.香连丸对抗生素相关性腹泻的治疗作用首先,依据前期实验结果,选择头孢呋辛（200mg/kg）和左氧氟沙星（300mg/kg）混合物连续灌胃5天复制AAD模型。造模成功后,连续灌胃AAD小鼠不同剂量（500、1000、2000 mg/kg）的香连丸5天。实验期间观察小鼠的活动情况、饮食/饮水量、体重,根据腹泻评分标准进行腹泻程度及恢复程度评估。再对各组实验小鼠采用HE染色观察肠道结构受损情况,并采用ELISA法测定结肠中炎症因子水平;16S r DNA测序技术,分析肠道菌群的变化情况;采用免疫组化和Western Blot分别定性和定量结肠组织中Claudin-1和Occludin的表达;采用GC-MS检测小鼠盲肠粪便中的SCFAs水平。3.香连丸及有效成分体外对艰难梭菌形态、毒素释放、生物膜形成的影响利用全量倍半稀释法测定香连丸、萸黄连、木香、黄连碱、小檗碱、巴马汀、木香烃内酯及去氢木香内酯体外抑制艰难梭菌的MIC和MBC值;利用扫描电镜和透射电镜观察经过药物作用后的细菌形态变化;利用ELISA法测定了细菌碱性磷酸酶、大分子物质及毒素的含量变化;利用FDA/PI荧光染色分析细菌膜透性;利用SDS-PAGE法测定细菌蛋白质合成水平;采用结晶紫染色分析细菌生物膜生成。结果:1.抗生素相关性腹泻模型的构建试验的10种临床抗生素中,仅有6种抗生素（头孢拉定、庆大霉素、头孢呋辛、左氧氟沙星、头孢克肟、罗红霉素）单用引发了明显的腹泻现象,但小鼠出现腹泻时间晚,且持续腹泻时间短,腹泻率低,不适于作为AAD模型继续研究。采用抗生素联用,小鼠腹泻出现时间提早,且腹泻率高,其中头孢呋辛+左氧氟沙星使小鼠第3天开始出现腹泻,并持续到实验结束,腹泻率高达100%,腹泻评分也最高。观察结肠发现肠上皮脱落,局部可见溃疡及固有层裸露,并伴有大量炎性细胞浸润;进一步发现结肠组织中紧密连接蛋白表达下降;分析肠道菌群发现其多样性和丰富度下降,菌群结构也发生了显著变化,如在门水平上,厚壁菌门比例显著上升,拟杆菌门、变形菌门的比例降低;在科水平上,肠杆菌科比例上升;在属水平上,肠球菌属比例升高,而其他有益菌属比例下降。这些结果说明头孢呋辛与左氧氟沙星联用能有效复制AAD小鼠模型,其主要特征为腹泻、肠道炎症和肠道菌群紊乱。2.香连丸对抗生素相关性腹泻的影响采用头孢呋辛（200 mg/kg）+左氧氟沙星（300 mg/kg）连续灌胃小鼠5天后,成功复制AAD模型,出现中度至重度腹泻,且小鼠运动迟缓,体重、饮食/饮水量等发生显著变化。然而,经香连丸治疗减轻了腹泻状态,恢复了体重、活动状态和饮食/饮水量。进一步的分析表明,香连丸促进了肠道粘膜的恢复,恢复了Claudin-1和Occludin这两种蛋白的表达,并且经中剂量的香连丸治疗后,Occludin的表达水平恢复到了正常水平,说明香连丸有效恢复了肠道组织的完整性。香连丸还在门水平、科水平和属水平上恢复了肠道菌群的多样性和丰富度。尽管香连丸治疗组和自然恢复组之间没有显著差异,但香连丸的丰富度和多样性指数比自然恢复组更接近空白对照组水平。模型组小鼠的SCFAs的产生量急剧下降,经香连丸治疗后显著增加了其中主要成分乙酸、丙酸和丁酸的含量。3.香连丸及有效组分体外对艰难梭菌形态、毒素释放、生物膜形成的影响香连丸及其组分在体外对艰难梭菌ATCC 9689表现出中到弱的抑制活性,香连丸、萸黄连、木香、黄连碱、小檗碱、巴马汀、木香烃内酯、去氢木香内酯的MIC分别为0.391、0.781、0.781、1.563、3.125、3.125 mg/ml,MBC分别为0.781、3.125、＞6.25、3.125、3.125、6.25,＞6.25,＞6.25 mg/ml,其中萸黄连和木香组成的香连丸表现出最强的抑制活性。进一步研究证实,香连丸和小檗碱引起了细菌壁和膜破裂、蛋白质合成受到抑制。扫描电镜还观察到香连丸和小檗碱对孢子的形成有抑制作用。同时,香连丸及其组分对艰难梭菌ATCC 9689产生的毒素A和B均有抑制作用,而抑制毒素B的产生更为有效。值得注意的是木香及其单体木香烃内酯和去氢木香内酯对艰难梭菌ATCC 9698无抑菌活性,但也阻断了毒素A和B的产生。本研究还证实香连丸、萸黄连、黄连碱和小檗碱能有效地抑制艰难梭菌ATCC 9689的生物膜形成。结论:1.联用抗生素比单用抗生素更容易引起小鼠腹泻,如头孢呋辛（0.20g/kg）+左氧氟沙星（0.26g/kg）连续灌胃5天,所致小鼠腹泻率高达100%,且腹泻症状相对稳定,到实验结束还可见明显腹泻,可以作为抗生素相关性腹泻模型,进行后续相关研究。同时,所致腹泻小鼠可见明显的结肠结构受损及炎症细胞浸润现象以及肠道菌群紊乱。2.香连丸治疗抗生素相关性腹泻可通过调节炎症因子水平和维持紧密连接蛋白的表达,改善肠道微生物群的多样性和丰富度、增加SCFAs的产生来实现。虽然确切的机制需要进一步探究,但可以肯定的是香连丸对抗生素相关性腹泻具有潜在的治疗作用。3.香连丸和小檗碱可通过破坏艰难梭菌的菌壁和菌膜以及抑制蛋白质合成来抑制艰难梭菌ATCC 9689的生长,从而导致毒素的产生和生物膜的形成也受到一定抑制。