TGFβ与创伤后晶状体上皮细胞转分化

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目的: 对超声乳化术后囊袋与正常晶状体囊袋组织所表达的基因进行筛查分析,探索调控晶状体上皮细胞创伤后增生、分化、转分化的潜在因素。观察TGFβ2作用于人晶状体上皮细胞后,通路转导蛋白的动态表达,及其对细胞周期和转分化特异性标记物表达的影响。尝试活体观察不同分区晶状体上皮细胞手术创伤后反应差异。探索TGFβ对晶状体上皮细胞转分化的效应特点和机制。 方法: 1.使用DNA基因芯片技术对兔眼超声乳化术后14d的晶状体囊袋组织和未手术眼囊袋组织所表达的差异基因进行筛查。 2.体外培养的人晶状体上皮细胞中添加10ng/mlhTGFβ2,用RT-PCR方法测定30min、1h、2h、8h、16h、24h等不同时点Smad4mRNA的表达,用Westernblot和免疫组织化学方法观察上述时点p-Smad2/3的表达。 3.利用流式细胞技术测定TGFβ2刺激晶状体上皮细胞后,24h和72h的细胞周期分布变化。RT-PCR检测24h、48h和72h时点αSMA和COL-ⅠmRNA表达,免疫组织化学方法观察αSMA和COL-Ⅰ蛋白表达。 4.将晶状体中央前囊膜片再植入于兔眼超声乳化术后囊袋中,组织切片观察术后再植片与赤道部细胞形态变化,免疫组织化学法观察两者Smad4表达的差异。 结果: 1.DNA基因芯片检测超声乳化术后囊袋组织,可发现上调基因47个,下调基因11个(以2.0倍显著差异水平筛选)。其中包括TGFβ通路蛋白基因Smad7表达明显上调2.2倍;以及与细胞分裂转化相关的基因,如Fos、Csl等。 2.人晶状体上皮细胞添加了外源性hTGFβ2后1h,即可出现Smad4mRNA表达转录强度增高(0.18±0.02),16h到达峰值(0.72±0.07)并至少持续至24h。与对照组存在显著差异(P<0.05)。30min测得p-Smad2/3的蛋白表达与对照组相似,但在2h后逐渐增强,与对照组出现明显差异,16h达到峰值(2.53g/L)。免疫组织化学染色在16h有p-Smad2/3颗粒胞浆表达,24h向核内聚集。 3.TGFβ2作用晶状体上皮细胞后24h,测得G0-G1期细胞百分比55.26±1.76%、S期细胞24.16±3.13%;72h测得G0-G1期细胞百分比64.56±3.72%,S期细胞35.38±3.71%,G0/S与对照组相比有统计学显著差异(P<0.05)。TGFβ2作用晶状体上皮细胞后,24h和48h表达αSMAmRNA(0.37±0.05和1.31±0.07),与对照组(0和0.98±0.02)存在统计学显著差异(P<0.05);48h和72h表达COL-ⅠmRNA(0.62±0.20和0.54±0.21),与对照组(0、0)存在统计学显著差异(P<0.05);48h细胞形态发生不规则梭形改变;αSMA和COL-Ⅰ免疫组织化学染色阳性。 4.中央前囊膜片囊袋内再植入模型构建成功,术后14d,赤道部和中央前囊再植入片上细胞均出现增生和纤维化生表现;前囊再植片细胞Smad4表达阳性,赤道部为阴性。 结论:TGFβ2刺激晶状体上皮细胞后,可激活膜受体激活型Smad和通用型Smad,同时改变了细胞周期的分布和诱导晶状体上皮细胞转分化的标记蛋白αSMA和COL-Ⅰ的表达。TGFβ是晶状体上皮细胞创伤后向成肌纤维样细胞转分化的重要始动调节因子。
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