研究背景与研究目的糖尿病肾病(DN)是糖尿病的一种严重的微血管并发症,是世界范围内终末期肾病(ESRD)的主要病因,给社会和家庭带来了巨大的经济负担。DN的主要病理改变在早期是肾小球肥大,细胞外基质(ECM)成分如FN和Ⅰ型胶原蛋白增多,肾小球基底膜增厚,如不及时治疗,就会发展为肾小球硬化和肾小管间质纤维化,造成不可逆损伤,最终进展为ESRD。而氧化应激和慢性炎症反应可以导致肾脏系膜细胞中TGF-β和ECM蛋白表达上调,加重肾脏病理学改变,从而在促进DN的发生和发展中发挥着重要的作用。肾素-血管紧张素系统(RAS),特别是肾脏局部RAS的激活,通过血管紧张素转换酶(ACE)产生的血管紧张素(Ang)Ⅱ水平升高,在DN的进展中起着重要作用。Ang Ⅱ通过其1型受体(AT1R)发挥多种效应,包括血管收缩、水钠潴留、细胞增殖和凋亡、慢性炎症和氧化应激。这些作用单独或协同起作用,可以导致肾小球纤维化、肾小球通透性增强和明显的蛋白尿。尽管血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和/或血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)阻断RAS是目前DN的标准治疗方法,但在减少蛋白尿、改善肾脏组织学和预防疾病进展方面,ACEI和/或ARB都只有部分反应,并不能阻断或逆转DN的进展。因此,我们需要寻找新的替代和/或互补的方法来抑制RAS的活化。血管紧张素转换酶2(ACE2)是ACE的一种同源酶,能将Ang Ⅱ降解为Ang 1-7,减轻Ang Ⅱ对DN动物模型的不利影响。ACE2在正常肾脏中高表达,但在DN大鼠中表达下调。糖尿病小鼠模型中ACE2的药物抑制或ACE2基因敲除可加重糖尿病肾病的肾小球损伤,促进蛋白尿,提示ACE2的减少导致AngⅡ的积聚,是DN发病的主要因素之一。因此,旨在增加ACE2表达的治疗方法可能会改善DN。间充质干细胞(MSCs)基因治疗是一种治疗急性肾损伤等多种疾病的新方法。此外,我们以前的研究表明,静脉注射MSCs可在链脲佐菌素(STZ)诱导的DN中发挥降低血糖、减少蛋白尿、改善肾小球纤维化和调节免疫平衡的作用。值得注意的是,MSCs具有“归巢”并直接对损伤细胞进行修复的能力,并可作为基因治疗的载体,携带保护性基因到受损部位并在局部过表达,这不仅可以增强保护性基因的治疗效果,还可以促进局部组织修复。因此,MSCs与ACE2保护基因联合应用可能是治疗DN的一种潜在策略。综上所述,在本研究中,我们在第一部分应用慢病毒-ACE2质粒转染MSCs,构建过表达ACE2的MSCs细胞株,并与肾小球系膜细胞(GMCs)共培养,探讨过表达ACE2的MSCs对Ang Ⅱ诱导的GMCs的保护作用及潜在机制;在第二部分中将过表达ACE2的MSCs经静脉移植入STZ诱导的糖尿病大鼠体内,探讨其对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及潜在的作用机制。研究方法1.细胞实验将分离得到的大鼠骨髓来源的MSCs进行体外培养,再通过绿色荧光蛋白(GFP)进行体外标记(命名为MSCsGFP),体外培养肾小球系膜细胞(HBZY-1细胞)。慢病毒-ACE2质粒分别用80和20的感染复数(MOI)转染MSCs和GMCs,分别命名为MSC-ACE2和GMC-ACE2。实时荧光定量RT-PCR和Western blot(WB)分别检测 MSCs、MSC-ACE2 和 GMCs、GMC-ACE2 细胞内 ACE2 mRNA和蛋白表达,ELISA方法检测MSCs、MSC-ACE2和GMCs、GMC-ACE2细胞培养基中分泌型ACE2蛋白表达。将GMCs与MSCs(MSCs或MSC-ACE2)进行间接共培养,然后用Ang Ⅱ刺激。为探讨Ang Ⅱ刺激后MSCs和ACE2过表达对GMCs的影响,将细胞分为5组:正常培养基培养的GMCs为正常对照组(GMC组),Ang Ⅱ刺激的GMCs(AngⅡ-GMC 组),Ang Ⅱ 刺激的 GMC-ACE2(AngⅡ-GMC-ACE2 组),AngⅡ刺激的GMCs和MSCs共培养(Ang Ⅱ-GMC-MSC组);Ang Ⅱ刺激的GMCs与MSC-ACE2共培养(AngⅡ-GMC-MSC-ACE2组)。刺激结束后,实时荧光定量RT-PCR 和 WB 法检测 GMCs 中的 collagen Ⅰ、FN、TGF-β mRNA 和蛋白表达,WB法检测GMCs中的Smad2/3、磷酸化Smad2/3表达;应用系膜细胞DHE荧光染色检测ROS的产生,分别用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定细胞培养液中的超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,利用检测试剂盒测定T-GSH、GSSG含量;实时荧光定量RT-PCR法和ELISA法分别检测GMCs中的IL-6、IL-1β、TNFα、IL-18、MCP-1的mRNA和蛋白表达以评估各组细胞的炎症状态;ELISA法检测各组GMCs的细胞培养基中的ACE2、Ang1-7蛋白,实时荧光定量RT-PCR法和WB法检测各组GMCs中ACE、ACE2、MasR、AT1R、AT2R的mRNA和蛋白表达。2.动物实验为了明确过表达ACE2的MSCs对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及潜在作用机制,一次性腹腔内注射STZ制备糖尿病大鼠模型,成模后MSCs或MSC-ACE2持续2周通过尾静脉注射到实验鼠体内作为实验组,设立正常组和DN组作为对照组。8周后,留取各组大鼠的血、尿及肾组织标本待检。运用实验室方法检测血糖、24小时尿白蛋白排泄、肌酐清除率及肾肥大指数等指标;运用PAS染色法观察肾小球纤维化程度;通过免疫组织化学染色法检测TGF-β、FN、collagenⅠ、MCP-1在肾组织中的表达;通过免疫组化检测GFP进行MSCs示踪;通过实时荧光定量 RT-PCR 法检测 TGF-β、FN、collagen Ⅰ、MCP-1、IL-6、IL-1β、TNFα、IL-18、ACE、Ang Ⅱ、ACE2、AT1R、AT2R、MasR 的 mRNA 表达;通过 WB法检测各组肾组织中TGF-β、FN、collagen Ⅰ、Smad2/3和磷酸化Smad2/3的蛋白表达;通过ELISA法检测各组血清中ACE、AngⅡ、ACE2、Ang1-7蛋白水平和肾组织中 IL-6、IL-1β、TNFα、IL-18、ACE、AngⅡ、ACE2、Ang1-7、AT1R、AT2R、MasR的蛋白表达;通过化学发光法检测肾冰冻切片上的ROS的表达;通过黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定肾组织中的SOD活性和MDA含量;利用检测试剂盒测定T-GSH、GSSG含量。研究结果1.MSC-ACE2对Ang Ⅱ刺激的GMCs的保护作用1.1大鼠骨髓来源的MSCs的培养与鉴定大鼠骨髓来源的MSCs多呈现成纤维细胞形态,贴壁生长,细胞核位于中央,细胞浆丰富。在适当的培养条件下可以向成脂细胞和成骨细胞分化,高表达CD29、CD90、CD44,低表达 CD34、CD45、CD11b。1.2构建过表达ACE2的MSC细胞株慢病毒质粒转染MSCs和GMCs的最适MOI分别为80和20。慢病毒-ACE2质粒转染后3天,实时荧光定量RT-PCR和WB检测的ACE2 mRNA和蛋白表达在MSC-ACE2中显著增加,分别是MSCs的294.80倍和5.72倍;ELISA法测定MSC-ACE2能将可溶性ACE2蛋白分泌到培养基中,比单独培养的MSCs高约3.61倍。而与GMCs相比,GMC-ACE2的ACE2 mRNA和蛋白表达分别显著增加了 100.80倍和2.43倍,GMC-ACE2也能将可溶性ACE2蛋白分泌到培养基中,比单独培养的GMCs高约2.16倍。慢病毒-ACE2质粒转染对MSCs向成脂细胞和成骨细胞分化的能力无明显影响。1.3 MSC-ACE2对Ang Ⅱ刺激的系膜细胞的纤维化的影响Ang Ⅱ刺激GMCs后,collagen Ⅰ、FN表达明显增加,TGF-β/Smad通路被激活。MSC-ACE2处理后,collagen Ⅰ、FN表达明显降低,TGF-β/Smad通路被抑制,且作用效果优于MSCs和/或ACE2单独干预组。1.4 MSC-ACE2对Ang Ⅱ刺激的系膜细胞的氧化应激的影响GMCs经过Ang Ⅱ刺激后,SOD活性及GSH/GSSG 比值降低,ROS和MDA含量明显增加。而与Ang Ⅱ-GMC组相比,MSCs处理组和/或ACE2基因转染组SOD活性及GSⅡ/GSSG 比值明显升高,ROS和MDA含量下降;MSC-ACE2处理组SOD活性和GSH/GSSG比值最高,ROS和MDA含量最低,与其他两组比较有统计学意义。1.5 MSC-ACE2对Ang Ⅱ刺激的系膜细胞的炎症的影响Ang Ⅱ刺激GMCs后MCP-1及炎症因子IL-6、IL-1β、TNFα、IL-18的表达明显增加,而MSCs处理组和ACE2基因转染组可以改善GMCs的炎症状态,MSC-ACE2处理组在改善炎症方面优于MSCs和/或ACE2单独干预。1.6 MSC-ACE2对Ang Ⅱ刺激的系膜细胞RAS的影响我们通过实时荧光定量RT-PCR和WB没有检测到GMCs中ACE的表达。Ang Ⅱ-GMC-ACE2 组和 Ang Ⅱ-GMC-MSC-ACE2 组培养液中 ACE2 和 Ang1-7 水平明显高于其他3组,而Ang Ⅱ-GMC-MSC-ACE2组ACE2和Ang1-7水平最高。经Ang Ⅱ刺激后,Ang Ⅱ-GMC组GMCs内ACE2蛋白水平显著降低,而AngⅡ-GMC-ACE2 组和 Ang Ⅱ-GMC-MSC-ACE2 组均显著升高,Ang Ⅱ-GMC-MSC-ACE2组明显高于Ang Ⅱ-GMC-ACE2组。MasR水平在五组间无显著性差异。AT1R水平在Ang Ⅱ刺激组显著高于GMCs组,但四组间无显著性差异。与正常组比较,Ang Ⅱ刺激后AT2R表达均下调,但Ang Ⅱ-GMC-ACE2和Ang Ⅱ-GMC-MSC-ACE2组AT2R表达均高于其他两组。2.MSC-ACE2对糖尿病大鼠的肾脏保护作用2.1 STZ诱导的糖尿病大鼠的MSCs示踪GFP免疫组化显示,移植后24小时,在糖尿病大鼠肾小球周围和血管附近有一定量的MSCsGFP存在,但移植后8周,MSCsGFP的数量明显减少。2.2 MSC-ACE2对糖尿病大鼠理化指标的影响跟DN组进行对比,MSCs或MSC-ACE2组的血糖、24h尿白蛋白排泄、血清肌酐清除率和肾肥大指数均显著降低,与MSCs单独治疗相比,MSC-ACE2治疗显著降低了 24小时尿白蛋白排泄。2.3 MSC-ACE2对糖尿病大鼠肾脏纤维化及ECM蛋白表达的影响PAS染色和免疫组化发现DN组大鼠的肾脏系膜区出现显著的ECM沉积,而MSCs和MSC-ACE2治疗可以使系膜基质增生减少,降低了 TGF-β、FN和collagen Ⅰ的表达,且MSC-ACE2的治疗作用优于MSCs。实时荧光定量RT-PCR和WB检测显示了同样的变化趋势,磷酸化Smad2/3与总Smad2/3比值的变化趋势与TGF-β相同。2.4 MSC-ACE2对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响DN组肾组织SOD活性及GSH/GSSG 比值明显低于正常组,ROS和MDA含量明显增加。而与DN组相比,MSCs和MSC-ACE2治疗改善了氧化应激,表现为SOD活性和GSH/GSSG比值明显升高,ROS和MDA含量下降;MSC-ACE2组优于MSC组。2.5 MSC-ACE2对糖尿病大鼠肾脏炎症反应的影响免疫组化及实时荧光定量RT-PCR显示DN组肾组织中MCP-1的表达水平升高,实时荧光定量RT-PCR和ELISA法表明DN组肾组织中炎症因子IL-6、IL-1β、TNFα、IL-18的表达增加,MSCs和MSC-ACE2治疗均能改善糖尿病大鼠肾组织的炎症状态,而MSC-ACE2优于MSCs治疗。2.6糖尿病大鼠肾脏和血清RAS成分的变化DN 组大鼠肾脏 ACE、Ang Ⅱ、AT1R、AT2R 表达上调,ACE2、Ang1-7、MasR表达下调。MSCs治疗对RAS的改变无影响,与DN组比较无显著差异。然而,MSC-ACE2治疗显著上调了 ACE2、Ang1-7和AT2R的表达,下调了 ACE和Ang Ⅱ的表达,它对AT1R和MasR的表达没有影响。ELISA法检测DN组血清ACE、Ang Ⅱ、ACE2、Ang1-7的表达均较正常对照组升高,MSCs治疗对血清RAS水平无明显影响,MSC-ACE2治疗对ACE无影响,但显著上调ACE2和Ang1-7的表达,下调Ang Ⅱ的表达。结论1.应用慢病毒-ACE2质粒转染MSCs具有较高的转染效率并过表达具有酶活性ACE2蛋白。2.过表达ACE2的MSCs能够减轻Ang Ⅱ诱导的GMCs的氧化应激及炎症反应,下调TGF-β/Smad信号通路,改善GMCs的纤维化,且优于MSCs或ACE2单独干预。3.过表达ACE2的MSCs定位于受损的肾脏,与单纯MSCs相比,其在改善肾脏局部氧化应激和炎症反应,下调TGF-β/Smad信号通路,改善肾脏纤维化方面具有优势。4.MSC-ACE2优于MSCs的肾脏保护作用潜在机制是ACE2在肾脏局部过表达,导致肾脏Ang Ⅱ表达减少,Ang1-7表达增加,也就是MSC-ACE2可以抑制肾脏局部RAS活化,对延缓DN的进展有额外的益处。