研究背景和研究目的:年龄相关的听力损失(ARHL)是最常见的慢性老年人感觉障碍。70岁以上的老年人容易发生ARHL。据世界卫生组织(WHO)估计,在2025年,60岁以上的人口将达到12亿;其中,5亿人预计患老年性聋。ARHL是由多种因素的相互作用引起的,包括耳蜗自身的老化、环境、遗传倾向性(遗传易感性疾病)和健康疾病。ARHL的主要病理包括毛细胞损失,血管纹萎缩,螺旋神经节神经元丢失以及中枢听觉通路的变化。毫无疑问,ARHL是一个复杂的、多因素的疾病,其涉及环境、遗传、营养和健康因素。人类遗传研究表明ARHL中25-75%的变异有遗传基础。这种常见的老年性疾病被认为与氧化应激密切相关。研究证实氧化应激和线粒体DNA(mtDNA)缺失在ARHL的病理生理中起主要作用。众多的研究发现表明,耳蜗的氧化损伤表现为年龄相关的抗氧化防御系统的下降和/或年龄相关的ROS水平的增加,这对ARHL的发展起着至关重要作用。目前为止通过药理学或者基因干预的方法靶向氧化应激可以帮助预防或减缓ARHL。已有研究报道补充某些抗氧化剂可以防止/减缓ARHL。然而,补充抗氧化剂从而达到治疗和预防ARHL的效果目前仍是有争议的和不确定性的。此外,这些化学抑制剂或者抗氧化剂在治疗ARHL中的短时间作用也限制了它们的临床应用范围。因此,对ARHL的抗氧化治疗需要具体了解ARHL的氧化应激机制,这可能为ARHL的治疗提供新的选择。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mechanistic target of rapamycin,mTOR)是调节许多细胞过程的丝氨酸/苏氨酸激酶。它可以组装成两种多蛋白复合物:雷帕霉素敏感的mTOR复合体Ⅰ(mTORC1)和雷帕霉素不敏感的mTOR复合体Ⅱ(mTORC2)。许多衰老和与年龄有关的疾病已经被证明与mTORC1信号通路相关。在过去的十年中,一些研究表明,通过抑制mTORC1通路能够抵抗日益增长的与年龄有关的疾病。越来越多的实验证据表明,在哺乳动物一些组织中,mTORC1作为热量限制(CR)的下游靶点,CR能够降低mTORC1的活性。一方面,CR通过下调mTORC1信号通路被认为在介导长寿和健康方面起到重要作用。另一方面,CR能够延长酵母、蠕虫、果蝇、蜘蛛、鸟和猴子的寿命也是众所周知的,此外CR在哺乳动物中能够起到延缓各种与年龄相关的疾病如癌症、糖尿病、白内障以及ARHL等等。因此,种种这些关于mTORC1与年龄有关的疾病之间的复杂关系的研究表明mTORC1可能在ARHL的发展过程中发挥潜在的作用。但是至今为止,关于mTORC1信号通路在老年性耳聋中的具体作用还不清楚。在目前的研究中,我们首先发现了在耳蜗衰老的NSE(感觉神经上皮细胞)中mTORC1的活性明显上升。用雷帕霉素抑制mTORC1或在NSE中基因特异缺失Raptor可以使C57BL/6J小鼠抵抗ARHL。此外,在机制水平,利用NSE特异条件性基因敲除TSC1小鼠模型,我们的研究结果表明,持续激活mTORC1可以打破耳蜗内的氧化还原平衡,从而导致早发的耳蜗毛细胞死亡和渐进性听力损失。在本论文中,我们使用两个有效的动物模型第一次阐明了 mTORC1通路在ARHL中的关键作用。这些结果表明,靶向mTORC1通路可能对预防和治疗ARHL提供新的治疗靶点。拟解决的科学问题:本论文需要围绕以下几个科学问题进行探讨:1)mTORC1信号通路与老年性耳聋的关系。2)mTORC1信号通路调节老年性聋的具体机制。3)过氧化物酶体在老年性耳聋中所起到的作用。4)自噬在mTORC1信号通路调节老年性聋的过程中扮演的角色。研究方法与取得的研究成果:我们所用的实验小鼠材料均采用的是C57BL/6J背景小鼠,C57BL/6J小鼠在三个月龄即开始出现听力的丢失,是目前为止研究老年性耳聋很好的模型。为了回答上述的科学问题,我们首先利用了 mTORC1信号通路下游的指示蛋白P-S6来显示mTORC1通路在成年C57BL/6J小鼠(2月龄)以及老年C57BL/6J小鼠(12月龄)的表达变化水平。免疫荧光化学和Western blot结果显示mTORC1信号通路在12月龄的小鼠NSE中被激活。有意思的是,mTORC1信号通路激活的部位主要位于毛细胞和部分的支持细胞(指细胞),而在螺旋神经节细胞和血管纹细胞中并没有检测到mTORC1通路的激活。这表明mTORC1信号通路的激活具有细胞特异性,且mTORC1信号通路很有可能在老年性聋的进程中发挥重要作用。Rapamycin(雷帕霉素)被证明是一种非常有效的mTORC1信号通路的抑制剂。我们首先用腹腔注射rapamycin的方法来研究降低mTORC1信号通路对C57BL/6J小鼠的听力的影响。我们发现,当对C57BL/6J小鼠从三个月开始持续不断的隔天注射一次rapamycin,ABR结果显示rapamycin对小鼠并没有产生副作用,第六个月时注射组和对照组开始出现听力水平的差别:注射组小鼠普遍比对照组的听力阈值低,随着年龄的增长其两组的差距变得更加明显。这表明对照组随着年龄的增长会出现老年性耳聋的症状,但是注射rapamycin的小鼠则抗老年性聋。Western blot结果显示小鼠耳蜗组织在注射rapamycin后P-S6的表达量出现极大下调,由此推测,rapamycin通过下调mTORC1信号通路的水平来阻止老年性聋的发生。腹腔注射rapamycin同时会影响很多其他的组织,其它的组织的mTORC1信号通路的水平变化可能对我们研究mTORC1对听力的影响产生一定的误导。鉴于此原因,我们利用Cre-loxP系统条件性基因敲除mTORC1信号通路的关键基因Raptor来研究是否在听觉感觉上皮细胞敲除mTORC1也会起到抗老年性聋的作用。结果如我们所料,对Raptor敲除小鼠(Raptor-/-)进行ABR检测和DPOAE(主要用来检测外毛细胞的放大)检测发现Raptor-/-小鼠在六月龄以后都比正常的小鼠听力阈值低。耳蜗基底膜铺片结果证明Raptor-/-小鼠其毛细胞丢失程度远比wi ldtype小鼠轻,而且其内毛细胞神经突触相比wi ldtype小鼠有更多的保留,数据统计分析具有统计意义。所有这些结果表明,在耳蜗感觉神经上皮细胞特异的敲除mTORC1可以起到抗老年性耳聋的作用。上述的结果表明升高mTORC1信号通路很可能在老年性聋的发病进程中发挥重要作用。那么到底升高mTORC1信号通路与老年性耳聋之间具体是什么样的关系呢?mTORC1信号通路受TSC1/TSC2复合物的抑制,敲除TSC1会导致mTORC1信号通路的过度激活。鉴于此,我们用TSC1耳蜗感觉上皮细胞条件基因敲除小鼠(TSC1-/-)来研究mTORC1信号通路的过激活对小鼠听力的影响。我们发现TSC1-/-小鼠的听觉系统发育没有异常,但是从P30天开始出现听力阈值的下降,同时伴随着毛细胞的丢失,随着时间的增长,听觉毛细胞丢失程度会越发严重,在4月龄的TSC1-/-小鼠外毛细胞基本全部丢失。这些结果表明,mTORC1信号通路的过度激活对小鼠听力的形成没有影响,但是确实对听力的维持影响巨大。毛细胞的过早丢失从而导致TSC1-/-小鼠出现渐进性耳聋。mmTORC1下游会影响很多下游的代谢信号通路,文献报道已知的下游信号通路有Notch、Erk、Wnt、氧化应激、蛋白合成等等。老年性耳聋和氧化应激有很密切的联系,氧化还原反应的失衡是导致老年性耳聋的发生的主要因素。鉴于此,我们把研究重点放到了氧化应激上。我们的研究结果显示,氧化应激的marker 4-HNE以及3-NT在TSC1-/-小鼠中表达量显著增强。这证明氧化应激在TSC1-/-小鼠听力维持中扮演了很重要的角色。为了进一步验证这一结论,我们用Q-PCR的方法检测维持氧化还原的反应平衡的酶的变化水平,结果显示许多前氧化基因mRNA表达水平在TSC1被敲除后明显升高,而抗氧化基因mmRNA表达水平明显降低。随后,我们用抗氧化剂NAC来处理TSC1-/-小鼠,数据表明NAC的处理能够小鼠的耳蜗免受氧化应激的破坏。由此我们可以推测,氧化应激很有可能是TSC1-/-小鼠毛细胞死亡和引起听力损失的主要因素。线粒体和过氧化物酶体两种细胞器是引起细胞内氧化应激的主要部位。线粒体是产生氧化应激的主要细胞器,使细胞内进行能量代谢的主要场所。近年来许多文献报道老年性耳聋与线粒体基因有关。我们用透射电镜的方法来观察发现在P30时尽管小鼠已经出现听力损失,其线粒体仍然呈现很好的形态:双层膜正常,线粒体嵴也非常明显。这表明线粒体可能此时没有出现明显的问题,TSC1-/-小鼠出现氧化应激进而耳聋是有别的因素引起的。此外,过氧化物酶体的功能障碍也可以导致ROS的积累,其与听力损失也密切相关。过氧化物酶体是非常动态的细胞器,它由内质网衍生而来,其主要细胞功能是与其它细胞组件互动并参与调节细胞的氧化还原状态。透射电镜的结果显示TSC1-/-小鼠的毛细胞内过氧化物酶体出现了明显的形态学缺陷:其有的过氧化物酶体出现了多个晶状核,许多过氧化物酶体膜结构胀破。这些结果表明,在mTORC1过度激活的小鼠中过氧化物酶体的破坏才是引起毛细胞氧化应激从而导致毛细胞死亡和小鼠听力丢失的最起始环节。TSC-mTORC1过度激活是如何影响到小鼠的过氧化物酶体的呢?我们发现TSC1/TSC2复合物定位于毛细胞的过氧化物酶体。这一结果表明TSC-mTORC1信号通路可能在过氧化物酶体上发挥作用。Rapamycin是一种非常常见的自噬促进剂,之前的报道证明自噬通过降低氧化应激起到抗噪声性耳聋的作用,我们的前期实验结果也证明Rapamycin能够阻止老年性聋的发生,且rapamycin能够阻止TSC1-/-小鼠耳聋的发生。我们推测,TSC1-/-小鼠其自噬水平可能遭到了破坏。我们将TSC1-/-小鼠与GFP-LC3转基因小鼠交配得到带有GFP-LC3转基因的TSC1-/-小鼠,并通过此工具来研究其自噬水平。由于小鼠本底的自噬水平较低,因此,我们利用给小鼠注射新霉素(一种常见的耳毒性药物)来激活自噬。结果显示,正常的GFP-LC3小鼠在连续注射新霉素5天以后,小鼠基底膜铺片显示点状聚集明显增多,而TSC1-/-/GFP-LC3小鼠其GFP-LC3荧光信号仍然在胞质中弥散性分布。这些结果表明,TSC-/-小鼠的耳蜗自噬水平遭到了破坏,TSC1-/-小鼠的自噬水平的破坏很可能在其氧化应激的形成中发挥了很重要的作用。在正常小鼠中自噬可以降低细胞内的ROS的水平,而在TSC1-/-中自噬水平遭到了破坏,使其升高的ROS不能被细胞自噬有效的清除掉,进而导致体内氧化应激和毛细胞的死亡。综上所述,TSC-mTORC1信号通路在老年性聋的进程中发挥着重要的作用,靶向mTORC1通路可能预防和治疗老年性聋。研究意义:①我们首次阐明了 TSC/mTORC1信号通路在老年性耳聋中发挥很重要的作用;通过下调mTORC1信号通路可以用来抗老年性耳聋,这对阻止和治疗老年性耳聋提供了很好的治疗靶点和理论依据。②本论文阐明了过氧化物酶体在耳毛细胞中的重要作用;过氧化物酶体的破坏也会引起听毛细胞的损伤,从而导致耳聋的发生。③TSC/mTORC1信号通路通过调节细胞内氧化还原的平衡从而来调节耳聋的进程。通过对TSC/mTORC1信号通路在听觉功能的研究,有助于加深我们对老年性耳聋的认识。