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研究目的
胰岛移植是治疗1型糖尿病的有效方法，是目前能够微创并有效控制糖尿病并发症的细胞治疗技术，可使患者恢复对血糖的应答和精确调控。但是，胰岛移植仍然受到移植物微血管重建，免疫排斥和其他炎症限制等问题的影响，加快微血管重建能够保证移植后的胰岛发挥功能。研究表明，碱性成纤维生长因子（bFGF或FGF-2）能够刺激血管生长及趋化血管内膜细胞增生，成为促进胰岛移植物血管重建的新焦点。但是bFGF的局限性在于在体内半衰期短，仅3~10min，稳定性差易水解，很难满足临床应用需要。本研究在体外将带有重组人成纤维生长因子（rhbFGF）目的基因的腺病毒导入胰岛，通过FDA-PI荧光染色评价rhbFGF对胰岛活性的影响，透射电镜观察感染后胰岛内微血管基底膜的修复情况，通过流式细胞术检测腺病毒感染率，通过糖刺激试验检测胰岛素释放功能；在体内将合适感染复数（MOI）的腺病毒感染后的胰岛移植至糖尿病小鼠肾被膜下，观察rhbFGF对糖尿病小鼠胰岛经肾被膜下移植后胰岛微血管重建作用，减少胰岛移植所需用量，达到稳定控制血糖的效果。
研究方法
1、根据本实验室成熟的小鼠胰岛分离纯化方法，得到实验所需大量的高纯度胰岛。
2、为了在体外评价不同感染复数（MOI）的rhbFGF腺病毒对胰岛细胞活性的影响及感染后对于内皮细胞修复的作用，本实验将rhbFGF腺病毒分成0MOI、50MOI、100MOI、300MOI和1000MOI六组，分别感染等量胰岛；并且在感染后36h、60h收集细胞样品，以透射电镜观察不同时间不同MOI腺病毒处理后胰岛细胞内分泌颗粒释放情况，并考察rhbFGF对胰岛内皮细胞修复的效果。通过不同MOIrhbFGF腺病毒对胰岛内部结构的影响及内皮细胞修复的初步结果，筛选体外实验适用于胰岛感染的最适腺病毒浓度及时间，初步评价bFGF在体外对胰岛内皮细胞的修复作用。
3、通过体外不同MOI（0、50、100、300、1000）的rhbFGF腺病毒感染胰岛，分别于0h、12h、36h、60h取细胞样品，经CMRL-1066洗涤后进行FDA-PI荧光染色，通过倒置显微镜观察，初步评价rhbFGF对感染后胰岛的活性及形态的影响。
4、通过体外不同MOI（0、50、100、300、1000）的rhbFGF腺病毒感染胰岛，于感染后12h后取细胞样品，经CMRL-1066洗涤后，使用胰酶消化成单细胞悬液，以流式细胞仪检测不同MOIrhbFGF腺病毒的荧光表达情况，初步筛选合适的感染复数。
5、经体外实验筛选出合适的MOI为100，结合本实验室成熟的小鼠胰岛肾被膜下移植方法，在体内将实验分成半量（200IEQ）rhbFGF胰岛移植组、半量GFP胰岛细胞移植组、全量（400IEQ）胰岛移植组与半量胰岛移植组，分别移植至糖尿病小鼠肾被膜下，通过对移植后小鼠连续30天的血糖监测及移植后第14天口服糖耐量试验，评价rhbFGF腺病毒感染后胰岛细胞移植对减量胰岛移植所起的作用；移植后两周取移植肾进行HE染色、免疫组化染色和WesternBlot检测，综合评价rhbFGF促进移植后胰岛微血管重建作用及抗胰岛凋亡的作用。
研究结果
1、通过体外不同MOI（0、50、100、300、1000）的rhbFGF腺病毒感染胰岛后进行体外实验。经透射电镜观察，1000MOIrhbFGF腺病毒处理后培养36h和60h后，胰岛内部结构破坏，完整性差且内分泌颗粒大量释放；而50MOI和100MOI腺病毒感染后胰岛培养36h和60h后，胰岛内部结构完整，内分泌颗粒释放良好，且对于胰岛细胞内皮细胞有一定修复的作用。
2、通过FDA-PI荧光活性染色结果显示，0MOI、50MOI、100MOI、300MOIrhbFGF腺病毒感染后胰岛形态圆整、清晰的边缘，取培养60h后细胞，FDA-PI染色中的绿色荧光统计结果显示，感染100MOIrhbFGF腺病毒的胰岛与0MOI胰岛之间的活性没有显着差异，均高于90%，而1000MOIrhbFGF腺病毒感染后胰岛活性低于75%，证明MOI过高对于感染后胰岛有明显的细胞毒性。
3、糖刺激结果显示，50MOI和100MOIrhbFGF腺病毒感染后胰岛对于葡萄糖有明显应答。
4、流式细胞仪分选结果显示，随着MOI增大，荧光表达量增高，感染率增高。
5、根据体外实验筛选确定100MOI为用于体内移植合适的感染复数。体内实验结果显示，半量rhbFGF腺病毒胰岛移植组与全量胰岛移植组相比，均能稳定控制血糖并维持在较低水平，且口服糖耐量结果表明两组对于葡萄糖有很好的应答，而与半量GFP腺病毒胰岛移植组和半量单纯胰岛移植组有显著性差异，说明半量rhbFGF腺病毒胰岛移植能显著增加胰岛功能，促进移植后胰岛存活并有效减少移植胰岛用量。
6、免疫组化染色和WesternBlot结果证明，半量rhbFGF腺病毒感染后胰岛的肾被膜下移植，能够加速移植后胰岛微血管重建和抗凋亡的作用。
结论
本研究表明100MOI为胰岛最合适的感染系数，且半量rhbFGF腺病毒感染胰岛后经肾被膜下移植可显著增强rhbFGF对胰岛移植后微血管重建的作用。通过移植后胰岛自身表达rhbFGF促进rhbFGF在移植部位持续发挥作用，有效延长了rhbFGF促进移植后胰岛微血管再生的作用时间，降低了胰岛因缺血缺氧导致移植物凋亡的影响，从而可以使移植所需的胰岛量减半，rhbFGF基因导入后胰岛促进移植部位微血管重建和移植物的抗凋亡作用，为提高胰岛移植疗效提供一种新的策略。
胰岛移植是治疗1型糖尿病的有效方法，是目前能够微创并有效控制糖尿病并发症的细胞治疗技术，可使患者恢复对血糖的应答和精确调控。但是，胰岛移植仍然受到移植物微血管重建，免疫排斥和其他炎症限制等问题的影响，加快微血管重建能够保证移植后的胰岛发挥功能。研究表明，碱性成纤维生长因子（bFGF或FGF-2）能够刺激血管生长及趋化血管内膜细胞增生，成为促进胰岛移植物血管重建的新焦点。但是bFGF的局限性在于在体内半衰期短，仅3~10min，稳定性差易水解，很难满足临床应用需要。本研究在体外将带有重组人成纤维生长因子（rhbFGF）目的基因的腺病毒导入胰岛，通过FDA-PI荧光染色评价rhbFGF对胰岛活性的影响，透射电镜观察感染后胰岛内微血管基底膜的修复情况，通过流式细胞术检测腺病毒感染率，通过糖刺激试验检测胰岛素释放功能；在体内将合适感染复数（MOI）的腺病毒感染后的胰岛移植至糖尿病小鼠肾被膜下，观察rhbFGF对糖尿病小鼠胰岛经肾被膜下移植后胰岛微血管重建作用，减少胰岛移植所需用量，达到稳定控制血糖的效果。
研究方法
1、根据本实验室成熟的小鼠胰岛分离纯化方法，得到实验所需大量的高纯度胰岛。
2、为了在体外评价不同感染复数（MOI）的rhbFGF腺病毒对胰岛细胞活性的影响及感染后对于内皮细胞修复的作用，本实验将rhbFGF腺病毒分成0MOI、50MOI、100MOI、300MOI和1000MOI六组，分别感染等量胰岛；并且在感染后36h、60h收集细胞样品，以透射电镜观察不同时间不同MOI腺病毒处理后胰岛细胞内分泌颗粒释放情况，并考察rhbFGF对胰岛内皮细胞修复的效果。通过不同MOIrhbFGF腺病毒对胰岛内部结构的影响及内皮细胞修复的初步结果，筛选体外实验适用于胰岛感染的最适腺病毒浓度及时间，初步评价bFGF在体外对胰岛内皮细胞的修复作用。
3、通过体外不同MOI（0、50、100、300、1000）的rhbFGF腺病毒感染胰岛，分别于0h、12h、36h、60h取细胞样品，经CMRL-1066洗涤后进行FDA-PI荧光染色，通过倒置显微镜观察，初步评价rhbFGF对感染后胰岛的活性及形态的影响。
4、通过体外不同MOI（0、50、100、300、1000）的rhbFGF腺病毒感染胰岛，于感染后12h后取细胞样品，经CMRL-1066洗涤后，使用胰酶消化成单细胞悬液，以流式细胞仪检测不同MOIrhbFGF腺病毒的荧光表达情况，初步筛选合适的感染复数。
5、经体外实验筛选出合适的MOI为100，结合本实验室成熟的小鼠胰岛肾被膜下移植方法，在体内将实验分成半量（200IEQ）rhbFGF胰岛移植组、半量GFP胰岛细胞移植组、全量（400IEQ）胰岛移植组与半量胰岛移植组，分别移植至糖尿病小鼠肾被膜下，通过对移植后小鼠连续30天的血糖监测及移植后第14天口服糖耐量试验，评价rhbFGF腺病毒感染后胰岛细胞移植对减量胰岛移植所起的作用；移植后两周取移植肾进行HE染色、免疫组化染色和WesternBlot检测，综合评价rhbFGF促进移植后胰岛微血管重建作用及抗胰岛凋亡的作用。
研究结果
1、通过体外不同MOI（0、50、100、300、1000）的rhbFGF腺病毒感染胰岛后进行体外实验。经透射电镜观察，1000MOIrhbFGF腺病毒处理后培养36h和60h后，胰岛内部结构破坏，完整性差且内分泌颗粒大量释放；而50MOI和100MOI腺病毒感染后胰岛培养36h和60h后，胰岛内部结构完整，内分泌颗粒释放良好，且对于胰岛细胞内皮细胞有一定修复的作用。
2、通过FDA-PI荧光活性染色结果显示，0MOI、50MOI、100MOI、300MOIrhbFGF腺病毒感染后胰岛形态圆整、清晰的边缘，取培养60h后细胞，FDA-PI染色中的绿色荧光统计结果显示，感染100MOIrhbFGF腺病毒的胰岛与0MOI胰岛之间的活性没有显着差异，均高于90%，而1000MOIrhbFGF腺病毒感染后胰岛活性低于75%，证明MOI过高对于感染后胰岛有明显的细胞毒性。
3、糖刺激结果显示，50MOI和100MOIrhbFGF腺病毒感染后胰岛对于葡萄糖有明显应答。
4、流式细胞仪分选结果显示，随着MOI增大，荧光表达量增高，感染率增高。
5、根据体外实验筛选确定100MOI为用于体内移植合适的感染复数。体内实验结果显示，半量rhbFGF腺病毒胰岛移植组与全量胰岛移植组相比，均能稳定控制血糖并维持在较低水平，且口服糖耐量结果表明两组对于葡萄糖有很好的应答，而与半量GFP腺病毒胰岛移植组和半量单纯胰岛移植组有显著性差异，说明半量rhbFGF腺病毒胰岛移植能显著增加胰岛功能，促进移植后胰岛存活并有效减少移植胰岛用量。
6、免疫组化染色和WesternBlot结果证明，半量rhbFGF腺病毒感染后胰岛的肾被膜下移植，能够加速移植后胰岛微血管重建和抗凋亡的作用。
结论
本研究表明100MOI为胰岛最合适的感染系数，且半量rhbFGF腺病毒感染胰岛后经肾被膜下移植可显著增强rhbFGF对胰岛移植后微血管重建的作用。通过移植后胰岛自身表达rhbFGF促进rhbFGF在移植部位持续发挥作用，有效延长了rhbFGF促进移植后胰岛微血管再生的作用时间，降低了胰岛因缺血缺氧导致移植物凋亡的影响，从而可以使移植所需的胰岛量减半，rhbFGF基因导入后胰岛促进移植部位微血管重建和移植物的抗凋亡作用，为提高胰岛移植疗效提供一种新的策略。