Clade 2.3.4.4基因型是2008年出现的H5亚型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)新型分支,并且这一分支包含 H5N2、H5N3、H5N5、H5N6和H5N8等多个血清亚型。最新的流行病学调查数据表明,clade 2.3.4.4已经成为我国H5亚型HPAIV的主要流行分支,同时H5N6亚型已经取代H5N1亚型成为优势流行血清亚型。H5N6亚型HPAIV宿主范围广,除水禽、野鸟和陆生家禽外,还能从猪和猫体内分离到,并且是目前除H5N1之外唯一能够感染人的H5亚型病毒,截至2020年3月,共报告24例人感染病例,其中8例死亡。AIV能够跨越种间屏障涉及的关键因素之一是病毒受体结合特异性的改变,后者主要取决于病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白。我们发现绝大多数 clade 2.3.4.4 H5NX 亚型 HPAIV 在 HA蛋白中具有T160A氨基酸突变,这一突变导致其158位的糖基化位点缺失。因此,探究这一位点的改变是否为H5N6亚型HPAIV的跨种间传播的关键因素及其对病毒的生物学特性的影响,将深化人们对于HPAIV跨种传播分子机制的理解,并为防控HPAIV引发的公共卫生风险提供理论支持。本研究针对158位糖基化位点存在差异的H5NX野毒株进行了受体结合分析,同时,构建了 160A/T两种模式的重组病毒对其受体结合特性以及生物学特性进行研究。首先评价模式病毒在不同来源细胞中的增殖能力和对小鼠的致病力,然后分析上述病毒在小鼠呼吸道的分布与复制情况,最后利用高通量测序技术解析158位糖基化位点存在差异的模式病毒感染细胞后基因的差异表达情况。1.Clade 2.3.4.4 H5NX HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对受体结合特性的影响我们对实验室从活禽市场分离到的clade 2.3.4.4分支的HPAIV H5N2(QD7),H5N5(031),H5N6(HX,Y6)和H5N8(WF1)病毒进行受体结合特性的分析,发现上述5株病毒的受体结合特性并不一致。进一步对其HA基因进行遗传进化分析发现031,Y6和WF1与大多数人源H5N6病毒一致,其HA蛋白呈T160A突变,造成158位糖基化位点缺失,这3株病毒均表现为双受体结合特性,而HX和QD7未缺失158位糖基化位点,表现为完全的α-2,3禽源受体亲和性。但是,这一单位点突变对clade 2.3.4.4 H5NX病毒HA骨架的影响尚不清楚。因此,我们针对母本病毒Y6和HX构建了 4株重组病毒,命名为 Y6-P-160A,RY6-P-160T,HX-P-160T 和 RHX-P-160A,分别保留母本病毒的外部基因HA和NA,内部基因盒由PR8(H1N1)提供。对4株重组病毒进行受体结合特性分析,发现Y6-P-160A和RHX-P-160A均表现为双受体类型的结合特性,而RY6-P-160T和HX-P-160T仅能与α-2,3禽源受体结合。此外,4株重组病毒在不同来源细胞中增殖能力测定结果表明,在禽源CEF细胞中,RHX-P-160A的复制能力最弱,而RY6-P-160T的复制能力最强,但4株重组病毒的复制滴度峰值差异不显著。在哺乳动物细胞中,以Y6为母本病毒构建的重组病毒的复制能力强于以HX为母本病毒构建的重组病毒,但模式病毒Y6-P-160A与RY6-P-160T之间,HX-P-160T与RHX-P-160A之间复制能力的差异不大。在小鼠致病模型中,母本病毒Y6和HX均为低致病性,而4株重组病毒均表现为中等致病性,但与重组病毒RY6-P-160T和HX-P-160T相比,Y6-P-160A和RHX-P-160A能够以更低接种量、更短时间内致死小鼠,上述结果与受体结合特性测定结果吻合。我们进一步构建了 HPAIVH5N2,H5N5和H5N8毒株的类似重组病毒,证实了 158位糖基化位点的缺失同样是其获得α-2,6人源受体的关键分子标记。因此,我们得出结论,HA基因中T160A突变导致158位糖基化位点的缺失是clade2.3.4.4 H5NX亚型病毒的双受体结合特性的决定因素。这一分子标记可能有助于预测、管控H5NX重组病毒跨种传播的风险。2.H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒生物学特性的影响为了进一步探究158位糖基化位点在H5N6亚型原病毒骨架中的作用,我们继续构建了 4株重组病毒,分别命名为RY6、RY6-160T、RHX和RHX-160A;其中,RY6-160T和RHX-160A均在HA蛋白的160位进行了突变;而RY6和RHX则在母本病毒Y6、HX骨架基础上进行了重组病毒的拯救。对小鼠的致病性分析发现,重组病毒RY6-160T和RHX的致病性显著高于RY6和RHX-160A,这与上一章以H1N1内部片段构建的重组病毒的致病性测定结果不同,后者的致病性分析结果提示,4株病毒的MLD50值由高到低分别为RY6-160T(105.17EID50)、RHX(106.5 EID50)、RY6(106.67 EID50)、RHX-160A(>107.0 EID50)。因此,我们进一步分析了 RY6和RY6-160T重组病毒在小鼠脏器中的分布情况,与重组病毒RY6相比,RY6-160T在小鼠体内的分布更加广泛,在多种受检脏器内均可检测到病毒,而RY6只能在肺脏和心脏中检测到,上述结果与小鼠致病力测定结果一致。不同细胞中的生长动力曲线也表明,RY6-160T在受检的不同来源细胞中的复制效率高于RY6。以上结果清楚地表明,HA蛋白160位糖基化位点的修饰显著影响病毒的毒力,该修饰是否影响病毒的抗原性?我们将4株重组病毒与针对clade 2.3.4.4 H5NX病毒的Re-8疫苗株的阳性血清进行反应,发现上述血清与重组病毒反应的滴度接近,提示重组病毒的抗原性并未发生明显改变。进一步对重组病毒的热稳定性进行测定,发现虽然4株重组病毒都属于中等热稳定性毒株,但RY6和RHX-160A在56℃水浴60分钟后仍然能够感染细胞,而RY6-160T和RHX在同样条件下已失去感染性,暗示158位糖基化缺失的野毒株在热稳定性方面占优势。尽管RY6-160T和RHX在宿主体内均表现出更强的毒力,但通过豚鼠红细胞解凝试验和A549细胞吸附试验,我们发现RY6和RHX-160A与上述细胞受体的结合能力更强,能优先结合受试细胞。上述结果表明,H5N6 HPAIVHA蛋白158位糖基化位点缺失并不能显著提高病毒对小鼠的致病力,需要依赖于HA蛋白的其他突变位点和/或病毒的内部基因间的协同作用;但158位糖基化位点的缺失使得病毒更耐受高温环境且与宿主细胞的结合能力更强,这些优势提高了 158位糖基化位点缺失的clade 2.3.4.4 H5NX在自然界的生存能力,最终使得这些毒株的流行面更广。3.H5N6 HPAIV HA蛋白158位糖基化位点修饰对病毒复制与宿主免疫应答的影响由于哺乳动物呼吸道α-2,3受体的分布不同于家禽,因此AIV通常更适合在哺乳动物的下呼吸道有效复制,而HPAIVHA蛋白158位糖基化位点直接影响病毒的受体结合特性,我们进一步检测了重组病毒RY6和RY6-160T感染小鼠的鼻甲骨、气管和肺脏三种脏器中的病毒含量,发现在鼻甲骨中RY6的含量显著高于RY6-160T,说明RY6在上呼吸道也能够有效复制。同时,我们分析了两株病毒感染后不同时间刺激宿主产生细胞因子的水平,RY6入侵宿主后在更短时间内刺激了炎性细胞因子HMGB1,IL-10和TNF α的产生,且其表达量也高于RY6-160T感染鼠;随着感染时间的延长,细胞因子的表达量逐渐下降,而RY6-160T在感染后期刺激产生的细胞因子水平显著高于RY6,过量的炎性因子最终可能导致了其对小鼠的致病性更强。我们使用高剂量重组病毒RY6、RY6-160T感染A549细胞,发现RY6在感染后3h和6h检测到的病毒滴度更高,但至感染后期9h后不再表现出复制优势。可能的原因:一方面,RY6结合A549细胞的能力更强;另一方面,病毒样颗粒形成试验结果表明,RY6-160T组装病毒粒子以及出芽的效率显著高于RY6,同时RY6-160T诱导细胞凋亡的能力也强于后者。两株病毒感染A549细胞的差异转录组学分析结果显示,RY6刺激宿主细胞表达的差异基因数量远远高于RY6-160T,说明RY6感染后启动了机体更广泛的调控机制。进一步的生物学功能分析发现,RY6感染A549细胞后引起了一系列负调控病毒复制的差异基因表达,干扰了病毒的入侵、复制与转录。KEGG通路分析证实了这一结论,即RY6感染细胞后激活了 NOD-like受体通路、p53信号通路和NFκB通路等相关通路。此外,我们发现两种宿主蛋白EGFR和MYH9可能在病毒结合细胞表面唾液酸受体后进一步协助病毒入侵细胞。因此158位糖基化位点缺失的RY6重组病毒能够在感染后启动宿主的免疫应答机制拮抗病毒,最终使得病毒的致病性趋于温和,从而有利于病毒的传播,而158位糖基化位点未缺失的RY6-160T重组病毒则刺激宿主表达过量的炎性因子,使其对宿主的致病性更强,与我们在小鼠模型中致病性试验中观察到的结果一致。综上所述,通过本文研究,主要得出以下结论:(1)Clade2.3.4.4H5NXHPAIVHA基因中T160A突变导致158位糖基化位点的缺失是该亚型病毒的双受体结合特性的决定因素;(2)Clade2.3.4.4 H5N6 HPAIVHA基因158位糖基化位点缺失不能显著提高病毒对小鼠的致病力,但该位点的缺失使得病毒更耐受高温环境,且与宿主细胞的结合能力更强;(3)H5N6HPAIVHA基因158位糖基化位点缺失的重组病毒能够在感染后启动宿主的免疫应答机制,使得病毒对小鼠的致病性趋于温和;而该位点未缺失的重组病毒则通过刺激宿主表达过量的炎性因子,导致病毒对小鼠的致病性更强。