白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是对世界对虾养殖业危害最大的病毒之一。该病毒于1992年首次在我国台湾地区发现,随后在全球25个国家范围内被发现。据不完全统计,从2000年到现在全世界由该病毒引起的经济损失已经超过了 80亿美元;WSSV在我国很多地区广泛存在并经常性地出现暴发,造成了重大的经济损失。日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是我国重要的淡水经济养殖品种之一,近几年,我国的青虾养殖业迅速发展,年产量已达27万吨以上,养殖年产量较大省份有江苏、安徽、浙江。日本沼虾在养殖过程中不容发生病害。但在2015年,无锡首次发现携带有WSSV的日本沼虾,并没有出现白斑综合症相关的症状。由于WSSV的存在,日本沼虾有可能是WSSV新的宿主,一种新的病毒传播媒介,对其他WSSV易感易发甲壳动物的养殖造成潜在的威胁。鳃组织在水生生物控制渗透压、离子平衡和气体运输中扮演着至关重要的角色;肝胰腺是虾主要的免疫器官,是储存、代谢和解毒的重要场所。日本沼虾相关WSSV的组织病理学变化目前没有报道。本文研究了WSSV对日本沼虾的致病性及其引起的鳃和肝胰腺组织病理学变化,通过高通量测序的方法筛选了日本沼虾中与WSSV感染相关的免疫基因,并对一些重要的免疫基因作了表达模式分析。1.白斑综合症病毒对日本沼虾的致病性研究在同等条件下,我们用WSSV分别对日本沼虾和凡纳滨对虾进行攻毒实验,WSSV对日本沼虾的LD50是103.84±0.06 copies/g,WSSV对凡纳滨对虾的LD50是100.59±0.22 copies/g。WSSV对日本沼虾的LD50是其对凡纳滨对虾LD50的1000倍以上。通过套式PCR能在感染日本沼虾的鳃、肝胰腺、肌肉、胃、心脏、肠道、腹神经、表皮、步足、眼柄、精巢和卵巢组织中检测到WSSV。2.感染白斑综合症病毒日本沼虾的病理学研究通过观察5个不同感染时间点(0、24、48、72和96 h)日本沼虾的肝胰腺、鳃和肌肉组织病理切片,WSSV首先在肝胰腺中引起肉眼可见病变(24 hpi),表现为F和R细胞数量增加,并伴随着出现染色体边缘化的肥大细胞核,增大的细胞核常含有一个非常明显的嗜碱性病毒包涵体,核固缩也出现的比0 h时频繁,B细胞的尺寸相比0h有所增大;随后在鳃组织中也同样出现类似的病变(48 hpi),表现为血窦里出现血细胞渗透物(HI),鳃丝基层的融合(FL)和嗜碱性病毒包涵体。在整个观察周期内(0-96 hpi)肌肉组织中均为发现病变。在感染病毒0、24、48、72和96 h这个5个时间点的日本沼虾肝胰腺WSSV的浓度分别为0、103.9、102.8、103.5和 102.6 copies/g,鳃组织 WSSV 的浓度分别为 0、0、103.0、103.5和102.7 copies/g,5个时间点的肌肉组织的WSSV浓度均为0 copies/g。病毒的清除现象分别出现在肝胰腺和鳃组织的48hpi和96hpi,同时伴随着对应组织病毒浓度的下降和嗜碱性病毒包涵体的数量的减少。实验结果表明日本沼虾能被WSSV感染,且随着时间的推移感染可以自愈。日本沼虾可作为一个研究抗WSSV的动物模型。3.日本沼虾免疫相关基因的筛选通过高通量测序,对感染WSSV后处于濒死状态下的日本沼虾肝胰腺和对照组日本沼虾肝胰腺的转录组比较分析,同时对比分析了感染WSSV后处于存活状态的日本沼虾肝胰腺和对照组日本沼虾肝胰腺的转录组。经过测序,分别从日本沼虾濒死、存活和对照组的肝胰腺组织中获得51924787、51969106和52605014的raw reads,去除低质量序列(序列碱基数少于20 bp)后,分别从日本沼虾濒死、存活和对照组的肝胰腺组织中获得了 50696076、49870542和50948257的高质量clean reads,碱基数分别约为7.6Gb、7.48Gb和7.63Gb。用Trinity软件对测序数据进行拼接后,共获得64049个unigene。对比分析濒死日本沼虾肝胰腺和对照组日本沼虾肝胰腺转录组后,获得1960个差异基因,其中上调基因有764个,下调基因有1196个;在1960个差异基因中,1392个基因是濒死组和对照组共有的,其中有443个上调基因和886个下调基因;321个差异基因只在濒死组中存在。存活的日本沼虾肝胰腺和对照组日本沼虾肝胰腺转录组对比后,获得4311个差异基因,其中上调基因有3308个,下调基因有1003个;在4311个差异基因中,2531个基因是存活组和对照组共有的,其中有1825个上调基因和589个下调基因;1483个差异基因只在存活组中存在。对比分析2个比较组的差异基因,4011个差异基因只在存活组和对照组的比较库中,其中包含3213个上调基因和798个下调基因;1660个差异基因只在濒死组和对照组的比较库中,其中包含699个上调基因和991个下调基因。2个差异基因库中,有300个差异基因是2个差异库共有的,其中包含95个上调基因和205个下调基因。为了确定差异基因的生物学功能,对获得的差异基因进行了 GO聚类和KEGG信号通路富集分析,获得88个免疫相关基因。这些免疫基因划分为13个功能类别和4个信号通路,其中抗生素(1个基因),蛋白酶(11个基因),蛋白酶抑制体(2个基因),细胞死亡(5个基因),细胞粘附(9个基因),热蛋白(2个基因),氧化应激(10个基因),识别病原体的免疫受体(4个基因),信号通路(Wnt信号通路5个基因,PI3K/AKT/mTOR信号通路3个基因,MAPK信号通路17个基因,JAK/STAT信号通路3个基因,泛素-蛋白酶信号通路6个基因)和其他免疫基因(20个基因)。4.感染白斑综合症病毒日本沼虾免疫先关基因的表达模式分析从差异基因库中挑选了10 个(glutathione s-transferase(GST)、copper/zinc superoxide dismutase 4(Cu/Zn SOD 4)、heat shock protein 21(HSP21)、interferon regulatory factor(IRF)、extracellular signal-regulated kinases 1/2(ERK)、MAP kinase-activated protein kinase 2(MKK2)、MAP kinase-activated protein kinase 4(MKK4)、c-Jun N-terminal kinase(JNK)、inhibitor of apoptosis protein(IAP)和 ferritin)重要的免疫相关基因,研究了其在感染WSSV不同时间的日本沼虾肝胰腺中的表达量变化趋势。这10个基因在日本沼虾感染WSSV24h的肝胰腺中的表达量均发生了极显著的升高。