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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,并且已经成为女性癌症相关性死亡的首要原因。尽管乳腺癌早期确诊患者出现远处转移的比例仅有5%-10%,但患者在行原发肿瘤切除术和辅助放疗等治疗后发生远处转移的机率仍很高。乳腺癌的转移带来很大的临床负担,亟需寻找乳腺癌转移相关蛋白并以此为靶标抑制乳腺癌的转移。本课题组前期工作中发现的转移相关短肽B04能够特异性结合PC-3M细胞膜表面的ATP5B,进而抑制细胞的迁移、侵袭,提示细胞膜ATP5B能够促进前列腺癌细胞的迁移、侵袭。ATP5B作为F1Fo ATPase的β亚基曾一度被认为严格定位于线粒体内膜,但越来越多的研究表明,ATP5B可异位表达在多种正常细胞和肿瘤细胞细胞膜,并通常定位于细胞膜小凹处。Cav-1作为细胞膜小凹重要的结构蛋白,与小凹的形成密切相关,是多条信号通路的枢纽。本研究旨在探究细胞膜异位表达ATP5B对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响并初步探讨Cav-1在该过程中的功能。方法:1.细胞膜异位表达ATP5B对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响胆固醇处理乳腺癌细胞MDA-MB-231,提取细胞膜蛋白,通过Western blot技术检测胆固醇负荷不同时间,细胞膜ATP5B异位表达的情况。应用Transwell小室迁移、侵袭实验,检测细胞膜ATP5B是否参与胆固醇促进乳腺癌细胞迁移、侵袭的过程。2.Cav-1在细胞膜异位表达ATP5B促进乳腺癌细胞迁移、侵袭过程中发挥的作用运用免疫荧光双重染色方法,从形态学上确定MDA-MB-231细胞膜ATP5B与Cav-1的位置关系;提取细胞膜蛋白,用免疫共沉淀技术从蛋白水平进一步明确两蛋白结合情况。乳腺癌细胞MDA-MB-231中,用含有针对Cav-1基因shRNA的质粒(能够表达指示蛋白GFP)转染细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定knock down Cav-1的细胞株并通过RT-PCR、Western blot方法从m RNA、蛋白水平鉴定knock down效果。Western blot检测knock down Cav-1后,对细胞膜Cav-1的影响;免疫共沉淀技术检测knock down Cav-1对细胞膜ATP5B与Cav-1结合的影响。分别用Transwell小室迁移、侵袭实验,比较knock down Cav-1影响ATP5B与Cav-1的结合,对乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。实验结果:1.细胞膜异位表达ATP5B对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响胆固醇处理不同时间后提取细胞膜蛋白,Western blot检测发现胆固醇处理12h组与对照组相比,细胞膜异位ATP5B表达明显增加;而胆固醇处理24h组细胞膜异位表达ATP5B与对照组无差别。Transwell小室迁移、侵袭实验检测发现,与对照组相比,短肽B04处理组细胞迁移、侵袭数目显著减少,而胆固醇处理组细胞迁移侵袭数目增加;B04+胆固醇处理组与B04单独处理组比较,细胞迁移、侵袭数目未发生变化。以上结果提示:细胞膜异位表达ATP5B能够促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭;胆固醇负荷能够促进乳腺癌细胞膜ATP5B的异位表达,但该作用不持久。胆固醇通过诱导乳腺癌细胞膜ATP5B的异位表达促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭。2.Cav-1在细胞膜异位表达ATP5B促进乳腺癌细胞迁移、侵袭过程中发挥的作用免疫荧光双重染色发现ATP5B与Cav-1在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞膜表面共定位;免疫共沉淀从蛋白水平明确了细胞膜ATP5B与Cav-1β的结合。经嘌呤霉素筛选的细胞株,通过RT-PCR和Western blot技术鉴定发现,Cav-1 shRNA1(质粒15806-1转染)组与scramble组相比,Cav-1 m RNA水平、蛋白表达水平明显下调;而Cav-1 shRNA2(质粒18201-1转染)组与scramble相比Cav-1蛋白、m RNA表达均无明显改变。说明质粒18201-1无Cav-1 knock down作用;用质粒15806-1转染细胞,成功获得了稳定knock down Cav-1的MDA-MB-231细胞株,以下统一用Cav-1 shRNA组表示。提取各组质膜蛋白,Western blot方法检测细胞膜Cav-1发现,Cav-1 shRNA组与scramble组相比,细胞膜Cav-1表达下调。用ATP5B抗体免疫沉淀Cav-1 shRNA组细胞膜蛋白,免疫沉淀产物中未发现Cav-1。Transwell小室迁移、侵袭实验结果一致:Cav-1 shRNA组细胞迁移、侵袭数目均较scramble组减少,且具有统计学意义。胆固醇处理前、后,Cav-1 shRNA组细胞细胞迁移、侵袭数目无变化。以上结果提示:ATP5B、Cav-1β在乳腺癌细胞膜表面结合,细胞膜异位表达ATP5B通过与Cav-1的结合发挥促乳腺癌细胞迁移、侵袭作用。结论:1、细胞膜异位表达ATP5B促进MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭。2、胆固醇负荷通过诱导ATP5B的细胞膜异位表达促进MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭。3、ATP5B与Cav-1β在乳腺癌MDA-MB-231细胞膜表面结合。4、细胞膜异位表达ATP5B通过与Cav-1的结合发挥促MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭作用。