5aza-C对菊花DNA甲基化及基因表达的影响

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本实验采用0、100、200、400μM四个浓度的5-氮杂胞苷(5-azaC)溶液分别对菊花品种“泉乡冲天”室外苗进行在体处理。观察记录叶片形状、植株高度和开花时间,测定生理指标叶绿素和丙二醛的含量。应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)和高效液相色谱(HPLC)检测各样本基因组DNA甲基化比例及模式。分析菊花表型变化与基因组DNA甲基化变化的关系。利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)进行基因差异表达分析,从而尝试揭示DNA甲基化对于菊花生长发育及基因表达的作用机制。实验结果如下:(1)表型:5-azaC处理30天后,和对照相比叶片发生卷曲。除此之外,菊花植株发生矮化,四组材料之间株高均有显著性差异,而且有剂量累加效应。去处理20天后,100μM处理组株高恢复和对照相近,200、400μM处理组恢复较慢,依然和对照有显著差异。开花时间和5-azaC的浓度相关,但不是规律性的正相关或负相关。四种浓度处理组的开花时间均有差异,和对照相比,100μM和200μM处理组花期分别提前9天和16天左右,并且,待三组菊花完全开放时,观察花型没有差异,说明5-azaC的处理没有影响其观赏价值。400μM处理组花期推迟3天左右。这表明高浓度的5-azaC有抑制作用。(2)生理指标检测:表型的变化和生理反应密切相关,所以本实验对相关的生理指标进行了检测。各样本叶绿素含量:100μM、200μM叶绿素含量稍高于对照组,400μM含量最少。丙二醛含量:400μM处理组丙二醛含量最高、其它三组相当。由此看来,低浓度的5-azaC对菊花的生理反应影响不大,高浓度的5-azaC对细胞有一定的伤害。(3)甲基化水平检测:以浓度为100、200、400μM的甲基化抑制剂5-azaC处理和未处理的菊花叶片基因组为材料,利用MSAP和HPLC技术对基因组DNA甲基化变化进行分析。结果发现,和对照组相比,各处理组甲基化水平均有所降低,并且随着5-azaC浓度的增加,甲基化降低的幅度也增加,而降低的趋势趋于平缓。(4)基因差异表达分析:以浓度为100、200、400μM的甲基化抑制剂5-azaC处理和未处理的菊花叶片总RNA为材料,利用cDNA-AFLP技术进行基因差异表达分析。结果显示,24对引物组合扩增出772条转录衍生片段(TDF),各处理组与对照相比均有差异表达条带,其中100μM处理组上调表达条带25个;200μM处理组上调表带的条带30个;400μM处理组上调表达的条带22个。选取提前开花组100-400bp之间的16条片段进行克隆测序,成功的10条,7条可以在NCBI中找到同源序列,为已知功能的基因,还有3条为未知基因。其功能主要参与信号转导、蛋白质代谢和抗病。
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