中国是世界上最大的农业国。多年来由于对农作物高产的需求,导致农业生产中肥料(特别是N、P肥)被过量、不合理施用,从而引发一些列环境和生态问题,如土壤酸化、水体富营养化、地下水污染等。因此,提高作物对土壤中矿质养分的吸收利用效率,减少化学肥料的施用,对维持农业可持续性发展和保护生态环境具有重要的意义。氮素(N)是植物必需的三大元素之一,也是农作物生产过程中最主要的限制因子。硝态氮(NO3-)和铵态氮(NH4+)是植物从土壤中吸收的两种主要的无机氮源。在自然生态系统中,土壤中的NO3-和NH4+由于植物根系吸收、化学固定、淋溶损失、硝化和反硝化作用等因素的影响,其有效性在时间上和空间上往往处于大幅度的波动过程中,这也造成了植物根系经常处于一个氮素养分亏缺的环境当中。植物为了应对自然界中的养分胁迫环境,已经进化出一系列的适应性机制,其中包括诱导高亲和力养分转运蛋白基因和与土壤中的丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi;简称AM真菌)形成互惠共生体系等。研究表明,植物中存在着受菌根共生诱导、负责共生界面NH4+吸收的转运蛋白基因。但至今尚未有直接证据证明菌根共生界面上存在运输NO3-的转运蛋白基因。前期我们从水稻丛枝菌根中鉴定到一个被强烈诱导表达的NPF家族基因OsNPF4.5。由于NPF家族中很多成员都被证实可以转运N03-,暗示了OsNPF4.5可能参与菌根共生途径N03-的吸收。为了验证这一假说,本项目通过定量表达分析、启动子驱动GUS报告基因、蛙卵异源系统功能验证等研究方法对该基因响应丛枝菌根共生的表达模式和功能进行了分析。所获结果如下:1.通过RACE获得了 OsNPF4.5全长cDNA序列。序列分析显示,该基因含有有七个外显子和六个内含子,开放阅读框全长为1830 bp,编码609个氨基酸。进化分析显示,OsNPF4.5位于植物NPF家族的第四个亚家族,与AtNPF4.1、AtNPF4.2、AtNPF4.3及OsNPF4.1同源性最高。2.通过沙培接种AM真菌(Rhizophagusirregularis)的实验证实了OsNPF4.5对丛枝菌根共生具有较强烈的响应。结果表明,OsNPF4.5在AM真菌侵染的水稻根系中被大量诱导表达,而在被侵染植株的地上部或未接种AM真菌植株的根系和地上部OsNPF4.5表达极微弱。而该亚家族中其它同源基因几乎都不受丛枝菌根共生诱导上调表达。3.对OsNPF4.5在不同形态氮处理和氮饥饿及恢复处理条件下的表达分析显示,OsNPF4.5对外源施加NO3-有明显的响应。对OsNPF4.5响应不同激素处理的表达分析结果显示,ABA和SA处理能够显著下调OsNPF4.5的表达水平,尤其在ABA处理的植株中下调尤为显著,但IAA、JA和GA对OsNPF4.5的表达没有显著影响。4.截取OsNPF4.5基因上游的2030 bp以及844 bp的启动子片段驱动GUS报告基因表达的实验结果表明,即该基因844 bp的启动子片段足以驱动GUS基因在烟草和大豆丛枝菌根中表达,且表达部位集中在被菌丝侵入形成丛枝的皮层细胞中。5.亚细胞定位结果显示OsNPF4.5编码的蛋白能够定位到细胞质膜上。在非洲爪蟾卵母细胞中表达该基因发现,OsNPF4.5编码的蛋白具有低亲和N03-转运功能。6.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了 OsNPF4.5的突变体纯合材料,为以后进一步研究该基因的生物学功能提供了实验材料。