论文部分内容阅读
实验目的子宫内膜癌(Endometrial cancer,EC)为女性常见恶性肿瘤,它的发病率位居乳腺癌、结直肠癌和肺癌之后。子宫内膜癌根据病因、临床表现、病理特点划为Ⅰ型及Ⅱ型。Ⅰ型是雌激素依赖型,即子宫内膜样癌(endometrioid endometrial carcinomas,EEC),而Ⅱ型是非子宫内膜样癌(non-endometrioid endometrial carcinomas,NEEC)。子宫内膜样癌占子宫内膜癌新发病例的70%-80%,与雌激素刺激有关。子宫内膜癌因为具有早期的临床症状,如不规则的阴道流血和阴道分泌物异常而易被早期诊断。对于早期的病例,手术是治疗的最佳选择,5年生存率约为96%。然而,一些晚期病例伴有腹部或盆腔疼痛、腹部膨隆、早饱、肠道或膀胱功能的改变,致使生存率急剧下降。尽管这些患者在疾病进展期阶段,使用了传统的化疗、放疗和激素治疗,但仍有很多患者对当前这些治疗不敏感。因此,新的肿瘤标志物的发现对子宫内膜癌的初期确诊与后期治疗有重要意义。Programmed cell death 4(PDCD4)最早作为一个细胞凋亡启动后表达上调的基因而被发现。后来,它被确定为一种新的肿瘤抑制基因,在阻止肿瘤的发生和发展,以及转录与翻译中有着重要的作用。一些研究已指出,PDCD4通过调节某些转录因子的活性来改变特定基因的转录,例如c-Jun、Sp1和p53基因。PDCD4抑制蛋白翻译通过以下两种不同的方式:第一种是eIF4A依赖机制,即PDCD4与真核翻译起始因子eIF4A联合,抑制eIF4ARNA解旋酶活性;第二种是eIF4A非依赖性机制,即PDCD4通过RNA结合结构域与多聚(A)结合蛋白(PABP)相互作用,从而调节蛋白的翻译。PDCD4在正常组织中广泛表达,包括肝、肾和大脑,但在多种人类肿瘤中表达下调或缺失,如肺癌、大肠癌、乳腺癌和卵巢癌。但是,PDCD4在EEC(子宫内膜样癌)患者中是如何表达的以及它在临床应用中的价值仍不清楚。本研究的目的是检测EEC组织与对照子宫内膜组织以及人子宫内膜癌细胞系KLE(低分化)(简称:人EC细胞系KLE)与对照子宫内膜腺上皮细胞中的PDCD4水平变化情况,并分析PDCD4水平变化情况与子宫内膜癌患者临床及病理特征的关联性,初步探索PDCD4在EEC发生、发展过程中所起到的影响。实验方法一、采用 Real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)技术测定 EEC与对照子宫内膜中的PDCD4mRNA的表达情况。二、采用Western blot技术测定EEC与对照子宫内膜中PDCD4蛋白的表达情况。三、采用IHC测定EEC与对照子宫内膜中的PDCD4蛋白表达水平及细胞定位。四、采用ICC测定人EC细胞系KLE与对照子宫内膜腺上皮细胞中的PDCD4表达水平。五、使用GraphPadPrism5软件分析。p<0.05被认为在统计学上存在差别。实验结果一、Real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)方法测定 EEC 与对照子宫内膜中PDCD4mRNA的含量情况。检测15份新鲜冰冻的EEC与18份对照子宫内膜中PDCD4 mRNA的含量情况。结果显示,EEC与对照子宫内膜之间的PDCD4mRNA的含量相似,没有统计学差异(p=0.88)。二、Western blot技术测定EEC与对照子宫内膜里PDCD4蛋白的含量情况。检测15份新鲜冰冻的EEC与18份对照子宫内膜中PDCD4蛋白的表达水平。结果显示,EEC与对照子宫内膜之间的PDCD4蛋白的含量相似,没有统计学差异(p=0.10)。三、IHC测定EEC与对照子宫内膜组织中PDCD4蛋白含量情况及细胞定位。1、检测52份EEC与70份对照子宫内膜(36份增生期、34份分泌期)石蜡切片标本。结果显示:在对照子宫内膜及EEC标本里,PDCD4的表达主要定位于对照组子宫内膜腺上皮细胞与EEC的胞浆。2、经统计学分析,增生期对照子宫内膜中PDCD4的表达明显高于分泌期的对照子宫内膜(p<0.001)。3、PDCD4在中分化或低分化EEC组织中的表达水平明显低于对照子宫内膜(增生期,proliferative phase)(p<0.001),PDCD4在高分化EEC标本中的表达程度明显高于对照组子宫内膜(分泌期,secretory phase)(p<0.001);然而,PDCD4的含量在高分化的EEC标本中与对照组子宫内膜标本(增生期)之间,以及中分化或低分化EEC组织中与对照组子宫内膜组织(分泌期)之间没有显著的统计学差异。四、采用免疫细胞化学技术(ICC)测定人EC细胞系KLE与对照子宫内膜腺上皮细胞中PDCD4的表达情况。1、在对照组腺上皮细胞和人EC细胞系KLE中,PDCD4染色主要定位于胞浆。2、PDCD4在人EC细胞系KLE中表达水平低,与在对照子宫内膜腺上皮细胞中的表达水平相似。五、EEC组织PDCD4蛋白表达与患者临床病理分期的关联性PDCD4蛋白的表达与患者年龄、浸润肌层深度、FIGO分期、ER和PR的高低程度没有关联性。然而,PDCD4蛋白的表达与EEC的分化程度却呈现显著关联性。PDCD4在高分化EEC中的表达水平高于中分化或低分化EEC水平(p<0.01),这提示我们PDCD4的低表达大概与EEC患者疾病的不良进展程度相关。实验结论一、PDCD4阳性染色多数定位在子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中,并且PDCD4在对照组增生期子宫内膜中的表达明显高于分泌期。二、中分化或低分化EEC中PDCD4的表达比对照组增生期子宫内膜组织明显降低。三、PDCD4表达与肿瘤的分化程度明显相关,在EEC高分化组里PDCD4的表达明显高于中分化或低分化组,这表明PDCD4在EEC的分化过程中有重要作用,提示PDCD4可用来评估EEC患者肿瘤恶性程度的一个潜在的有价值的指标。创新性及意义:一、我们发现和对照组增生期子宫内膜组织相比,PDCD4在中分化或低分化EEC组织里阳性率明显下降,而且其表达水平与肿瘤的分化程度显著相关,这为研究PDCD4在EEC中的作用和具体机制奠定了基础,同时为EEC的治疗提供了一个可能的方向。二、我们还发现PDCD4在子宫内膜分泌期与增生期的阳性指数明显不同,这提示PDCD4在子宫内膜中的表达受卵巢激素的调节。本研究的局限性本研究所收集的新鲜EEC组织数量较少,并且尚未进行体内外实验验证,在以后的研究当中我们会更深入地对PDCD4在EEC发生、发展中的作用进行探讨。