物质基础研究,即阐明什么药理作用由什么化学物质产生。中药发挥药效的物质基础往往是多成分的,因此要阐明药效物质基础,既要研究是哪些成分在起作用,也要研究他们各自的比例,即解决“是什么”、“有多少”的问题。桑叶是桑科植物桑Morus alba L的叶子,具有疏风清热、清肝明目的功效,在我国有悠久的栽培和药用历史,资源极其丰富,临床常用于治疗风热感冒、消渴症等,现代药理研究表明,桑叶具有降血糖、抗病毒、抗癌等多种生物活性,桑叶中的多羟基生物碱已被确认为降血糖的主要物质基础,而桑叶中抗病毒、抗肿瘤的物质基础研究尚不充分,为桑叶的综合利用及进一步开发带来了困难。本研究首先采用高效液相色谱法（HPLC法）建立了桑叶主要活性成分1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）、绿原酸、芦丁、槲皮素、r-氨基丁酸等的含量测定方法及指纹图谱,用以追踪主要化学成分在分离过程中的去向及转移率,为分离条件的优化、阐明物质基础提供定量、定性分析方法;采用高效液相色谱电喷雾串联质谱法（HPLC-MS/MS法）对桑叶中的化合物进行了分析,在对比文献的基础上,初步明确桑叶提取物中的主要物质组成,为物质基础的阐明提供基础（即物质基础是哪些化合物）;在活性成分的指引下,采用工业生产可行的分离方法对桑叶进行系统分离,得到粗多糖部位、生物碱部位及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共五个提取部位,并对部位Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行体外体外抗RSV评价,对部位Ⅲ进行了诱导细胞凋亡实验研究,初步确定桑叶中体外抗RSV、抗肿瘤的药效物质基础。方法:1、建立桑叶中活性成分的HPLC含量测定方法及指纹图谱。（1）HPLC法同时测定桑叶中芦丁、绿原酸和槲皮素。色谱柱为Kromasil C18柱（4.6×250 mm,5μm）柱;流动相为乙腈:甲醇:0.01 mol/L醋酸铵液（pH3.50）（20:10:70）;流速1.0 mL/min;柱温为25℃,检测波长为350 nm;（2）HPLC-ELSD法测定桑叶中的r-氨基丁酸。用Kromasil C18柱（4.6mm×250mm,5μm）,流动相为水:乙腈（90:10）,流速0.6min/ml,柱温25℃,进样10μL;ELSD气化室温度108.3°,氮气流速:3.0L/min。（3）HPLC-MS/MS法测定桑叶中1-DNJ含量。以乙腈:0.1%甲酸水溶液（12:88,v/v）为流动相,SHIMADZU HRC-NH₂柱分离,采用大气压化学电离源（APCI）,164.1/146.1,164.1/110.2两对离子,多反应监测。（4）桑叶HPLC指纹图谱的建立。色谱柱:C18（4.6mm×250mm,5μm）;流动相:乙腈（A）-水（C）-甲醇（B）,梯度洗脱,洗脱曲线:0～28min,A 5～35%,B95～65%,C 0%:28～35min,A 35～50%,B 60～0%,C 0～50%;35～60min;A50～60%,B 0%,C 50～40%。流速:1.0ml/mim柱温:25℃;检测波长:350nm;进样量:10μl。2、HPLC-MS/MS法分析桑叶中的化学成分。桑叶经50%乙醇回流提取,上液质联用进行分析,对各色谱峰质谱信号进行分析,初步确定桑叶提取物中主要化学成分。液相条件:色谱柱:Aglient Zorbax Extend C18柱（50×4.6mm,1.8μm）;流动相:A（甲醇）-B（乙腈）-C（水）,洗脱曲线为:0～8min,B4%～35,C94%～65,8～11minA0～40%,B35～60%,C65～0%;11～2lmin:A40～45%,B60～55%,流速:600μl/min,梯进样量:5μL,柱温:室温。质谱条件电喷雾电离源（ESI源）,负离子扫描,扫描范围m/z 100～1200。小口电压:-80V,入口电压:10V,温度350℃,碰撞气压力:12psi,雾化气压力:30psi。3、桑叶有效部位的提取分离将桑叶提取物进行了较为系统的分离,初步分成五个部位,分别为多糖部位、生物碱部位、Ⅰ部位,Ⅱ部位及Ⅲ部位,采用上述建立的分析方法对各分离部位有效成分进行定量分析,采用HPLC-MS/MS对各部位化学成分进行分析。4、以阳性药物利巴韦林注射液作为对照,对桑叶提取物Ⅰ部位,Ⅱ部位及Ⅲ部位进行体外抗呼吸道合胞病毒活性评价。药物毒性实验方法:Hela细胞常规传代培养,待长满后用胰酶消化,含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞悬液,以8×10⁵个/mL的细胞密度,加入96孔板中,每孔200μl,37℃,5%CO₂孵箱中培养24h,待细胞长成单层。吸出培养液,加入各浓度药液200μl,每个浓度8个复孔。正常对照只加入等体积2%的维持液。37℃,5%CO₂孵箱中培养,每24h观察细胞病变情况（CPE）,连续观察72h,记录实验结果。72h后,将药液吸出,每孔加入5mg/mLMTT（用PBS配制）200μl,37℃,5%CO₂孵箱中孵育2h后,弃上清,每孔加入DMSO200μl,室温下振荡混匀10min,在490nm下,酶联免疫检测仪测定吸光度值,并计算细胞存活率。采用SPSS13.0统计软件,Regression-probit回归将药物浓度与细胞存活率进行回归分析,计算细胞半数存活浓度。呼吸道合胞病毒（RSV）毒力测定:采用TCID₅₀微量法,用Reed-Munch公式计算TCID₅₀。药物抗病毒实验方法:药物在无毒浓度范围内,用2%的细胞维持液对药物进行倍比稀释,加入病毒液使病毒浓度为100TCID₅₀,混匀,阳性对照药为利巴韦林注射液（0.1g/mL）,用2%细胞维持液稀释,并加入病毒液,使利巴韦林终浓度为100μg/mL,病毒终浓度为100TCID₅₀,于37℃,5%CO₂孵箱中孵育1h。已长成单层Hela细胞的96孔板,吸掉培养液,每孔接种200μl各浓度药液与病毒的混合液,每个浓度8个复孔,同时设阳性对照组,病毒对照组和正常对照组,37℃,5%CO₂培养2h后,将药物组和病毒组液体吸出,加入细胞维持液继续培养,每日观察CPE。72h后将药液吸出,每孔加入5mg/mLMTT（用PBS配制）200μl,37℃,5%CO₂孵箱中孵育2h后,弃上清,每孔加入DMSO200μl,室温下振荡混匀10min,在490nm下,酶联免疫检测仪测定吸光度值。并计算药物对病毒的抑制率。采用SPSS13.0统计软件,Regression-probit回归将药物浓度与病毒抑制率进行回归分析,计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)、治疗指数（TI）。采用SPSS13.0统计软件,Onc-Way ANOVA对各药物不同浓度组、阳性对照组、病毒对照组、正常对照组间吸光度均数进行方差分析及组间多重比较,确定各药物组间及其与对照组间病毒抑制率是否有显著性差异。5、桑叶提取物Ⅱ、Ⅲ部位体外诱导Hela细胞凋亡的研究。常规培养的Hela细胞,待长至80%时,倒掉培养液,用PBS冲洗2次,分别加入用细胞培养液稀释的各浓度药液,正常对照组加入细胞培养液培养,置37℃,5%CO₂孵箱中培养,倒置显微镜观察细胞病变情况,24h、48h后,分别用0.25%胰酶消化收集细胞,1000rpm离心5min,弃上清,细胞用PBS洗2次,离心,弃上清,细胞用4℃,75%的乙醇固定4h以上,离心弃去固定液,PBS重悬5min,500～1000rpm离心5min,弃去PBS,1ml PI染液染色,终浓度为100μg/mL。4℃避光30 min,过400目筛后上流式细胞仪测试,Multicycles软件分析细胞凋亡率,采用SPSS13.0统计软件,One-Way ANOVA（方差分析）对Ⅱ、Ⅲ部位不同浓度组、正常对照组的细胞凋亡率进行方差分析,确定药物组间与对照组间细胞凋亡率是否有显著性差异。常规培养的Hela细胞,待长至80%时,倒掉培养液,用PBS冲洗2次,加入用细胞培养液稀释的各浓度药液,正常对照组加入细胞培养液培养,置37℃,5%CO₂孵箱中培养,倒置显微镜观察细胞病变情况,24h后,用0.25%胰酶消化收集细胞,1000rpm离心5min,弃上清,细胞用PBS洗2次,离心,弃上清,细胞用2.5%戊二醛固定过夜,常规脱水、超薄切片、染色、透射电镜观察细胞形态。结果:1、建立了桑叶中有效成分的含量测定方法及指纹图谱（1）建立了HPLC同时测定桑叶中芦丁、绿原酸、槲皮素含量的分析方法。在此条件下,芦丁线性范围为0.196～1.960μg,r=0.9998,样品的平均加样回收率为97.0%,RSD2.69%:绿原酸线性范围为0.158～1.580μg,r=0.9995,样品的平均加样回收率为96.9%,RSD 2.10%;槲皮素线性范围为0.0848～0.848μg,r=0.9992,样品的平均加样回收率为96.2%,RSD 2.90%。（2）建立了HPLC-ELSD法测定桑叶中r-氨基丁酸的方法,桑叶中r-氨基丁酸在0.476～4.760μg范围内呈线性,平均回收率为99.6%,RSD为2.43%。（3）建立了桑叶中1-DNJ的HPLC-MS/MS检测方法,1-DNJ保留时间为2.87min,标准曲线在482μg/L～2410μg/L范围内线性关系良好（r=0.9993）,平均加样回收率为95.8%,最低检测限为53.6μg·L^-1。（4）建立了桑叶提取物的HPLC指纹图谱,有18个峰出峰时间稳定可以用于定性分析,其中11个峰峰面积稳定,可以用于定量分析。2、桑叶化学成分分析结果从桑叶提取物中共检测出49个色谱峰。通过标准品对照、谱图中碎片离子结构分析及文献查阅,鉴定了奎尼酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、东莨宕苷、环桑皮素、槲皮素.双吡喃葡萄糖苷、槲皮素-双吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷、槲皮素-双鼠李糖苷、异绿原酸、芦丁、异槲皮苷、Moralbanone,紫云英苷、桑皮酮S、桑根皮素酸A、B、D、F,桑辛素C、桑辛素D、异戊烯羟基藜芦酚等26个化学成分。3、桑叶提取分离结果对桑叶提取物进行了系统的分离,得到5个提取部位,分别为多糖部位、生物碱部位、桑叶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部位,HPLC-MS/MS显示,桑叶Ⅰ部位化学成分主要为奎尼酸、绿原酸及其同分异构体、咖啡酸等化合物;桑叶Ⅱ部位主要为槲皮素—己碳糖苷类、异绿原酸、异槲皮苷、芦丁等化合物;桑叶Ⅲ部位主要为桑辛素及其同分异构体等化合物。4、桑叶有效部位体外抗RSV研究结果对桑叶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部位进行体外抗呼吸道合胞病毒活性筛选,结果桑叶Ⅰ部位表现出较好体外抗RSV活性,TC₅₀=37.98mg/mL,IC₅₀=0.4195mg/mL,TI=90.53;桑叶Ⅱ部位表现出较好体外抗RSV活性,TC₅₀=2.826mg/mL,IC₅₀=0.2493mg/mL,TI=11.32;桑叶Ⅲ部位在此条件下未表现出体外抗RSV活性;5、桑叶有效部位体外诱导Hela细胞凋亡实验结果对桑叶Ⅱ、Ⅲ部位进行体外诱导Hela细胞凋亡实验,结果Ⅱ、Ⅲ部位的不同浓度组处理24h,48h的细胞与正常对照组相比均有不同程度的凋亡,与正常对照组比均有显著性差异,且呈现一定的量效关系,说明桑叶Ⅱ、Ⅲ部位能诱导Hela细胞凋亡,电镜观察结果进一步证实。结论:桑叶体外抗RSV作用是多成分的共同作用,研究表明桑叶Ⅰ部位、Ⅱ部位均有较强的抗RSV的活性。化学成分分析表明:Ⅰ部位主要为奎尼酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸等,Ⅱ部位主要为槲皮素的己糖苷、桑素、芦丁、异槲皮苷、桑根皮素A、B、F等,初步确定其为桑叶体外抗RSV的主要物质基础。桑叶Ⅱ、Ⅲ部位具有较强的抑制Hela细胞生长和诱导细胞凋亡的作用,可能含有潜在的抗肿瘤成分,化学成分分析表明:Ⅱ部位主要含有槲皮素的己糖苷类、桑素、异绿原酸、异槲皮苷等化合物,有文献报道槲皮素的己糖苷类、桑素具有一定的抗肿瘤活性,可能是该部位抗肿瘤活性的主要成分;Ⅲ部位主要含桑辛素或其同分异构体以及分子量在200～400的小分子化合物,可能是该部位抗肿瘤活性的主要成分,具体成分尚需进一步的研究。