葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase,GOx）是一类参与碳代谢过程中的重要还原酶类,具有高效专一的生物特性,能够催化葡萄糖和氧气反应。使葡萄糖在氧气的作用下分解,生成一分子葡萄糖酸和一分子过氧化氢。葡萄糖和葡萄糖酸在食品工业和医学检测中承担着非常重要的作用。如葡萄糖作为供能物质,参与生命体内的新陈代谢。在医疗领域,血糖的测定常被作为判定人体是否健康的指标之一。而葡萄糖酸则被作为食品添加剂调节食物口感,其盐类产品作为保健品为人体补充微量离子。本论文旨在利用毕赤酵母的生物学特性实现葡萄糖氧化酶的高效表达,建立葡萄糖氧化酶高表达体系。分别通过毕赤酵母对遗传霉素G418耐受性进行体内多拷贝子的方式和通过pPICZαA进行体外多拷贝子筛选的方式来构建葡萄糖氧化酶高表达株,从中筛选高表达体系实现葡萄糖氧化酶的高效表达。进一步利用葡萄糖氧化酶与二氧化钛纳米晶构建基于底物通道的新型葡萄糖生物传感器,实现葡萄糖的快速检测。主要研究内容如下:（一）建立在毕赤酵母体内的葡萄糖氧化酶高表达体系1)葡萄糖氧化酶G418体内多拷贝子在毕赤酵母中的表达本章利用黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因构建pPIC9K-GOx重组载体,利用Sac I酶切位点线性化后电转入GS115酵母受体菌。经MD平板筛选将出重组子,将重组子涂布于含有遗传霉素（G418）的YPD平板进行多拷贝子筛选。设置0 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0.75 mg/mL、1.0 mg/mL、1.25 mg/mL、1.5 mg/mL、1.75 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL,4.0 mg/mL等11个浓度梯度,进行G418多拷贝子筛选。筛选出的阳性转化子经过3-5天培养后在各平板上随机挑选出菌落饱满,长势较好的单菌落21株。重组菌利用甲醇诱导蛋白表达120 h后测定其上清液的粗酶活。利用q-PCR（荧光定量PCR）方式测定重组菌的外源基因拷贝数,成功获得了含GOx基因的四种拷贝子重组菌。结果显示,四拷贝子重组菌酶活力最高,诱导120 h后酶活力达363 U/mL。2)葡萄糖氧化酶pPICZαA体外多拷贝子在毕赤酵母中的表达本章选用pPICZαA作为表达载体,利用BamH I和BgI II两个同尾酶在体外构建了一至六拷贝子,电转进X33酵母菌后利用YPDZ平板筛选GOx多拷贝子重组菌。结果表明在一定的范围内,目的基因拷贝数的增加有助于X33对葡萄糖氧化酶的分泌表达。超出这个范围,随着拷贝数的增高上清液的酶活反而有下降的趋势。各拷贝子菌株在添加甲醇诱导培养120 h后发现四拷贝子酶活力最高,为350 U/mL。（二）TiO₂纳米晶葡萄糖氧化酶电极的制备及性能测定葡萄糖电化学生物传感器是对葡萄糖定量检测的一种快速可靠的方法。纳米材料已广泛用于葡萄糖氧化酶酶电极的修饰,以增强电子传递效率及有效电化学比表面积。本研究利用醇热法合成了二氧化钛（TiO₂）纳米晶。测试发现合成的二氧化钛纳米晶颗粒具有较高过氧化物模拟酶活性。采用物理吸附法将TiO₂纳米晶与葡萄糖氧化酶共固定于玻碳电极表面,并以全氟磺酸（nafion）膜覆盖其表面,制成TiO₂纳米晶葡萄糖氧化酶传感器（Nafion/TiO₂/GOx/GCE）。利用该传感器检测葡萄糖,葡萄糖浓度在0.5-30mmol/L范围内呈线性关系,检出限为6.3×10-5 mol/L（S/N=3.0）。结果显示,TiO₂纳米晶葡萄糖氧化酶传感器（Nafion/TiO₂/GOx/GCE）很好地保持葡萄糖氧化酶的生物活性,并促进其对葡萄糖的氧化还原反应。该传感器对葡萄糖具有选择性较好,检测时不易受其他物质影响的优势,可用于对葡萄糖浓度的快速测定。