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研究背景类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病,由辅助性T细胞17（T helper cell-17,Th17）产生的多种细胞因子包括白介素17A（Interleukin-17A,IL-17A）和白介素17F（Interleukin-17F,IL-17F）参与其发病机制。Th17通过启动关节炎症反应,成为RA患者骨和软骨破坏的致病驱动因素[1]。Th17细胞和Treg细胞（Regulatory T cell）均具有特定的功能性基因,它们是从相同的幼稚CD4+T细胞（na?ve CD4+T cell）发育而来的,但在不同的细胞因子环境下发育[2]。典型的促炎性Th17细胞通过促炎性细胞因子（Cytokine）的诱导,导致自身免疫性组织炎症和关节损伤。此外,Treg细胞可抑制Th17细胞以及其他效应T细胞的活性。Treg细胞通过产生抗炎细胞因子,具有免疫抑制作用,能够维持机体自我耐受性并抑制自身免疫[3]。Th17/Treg细胞失衡与促炎/抗炎细胞因子产生的联系与RA疾病的发展进程有关,这又与患者自身免疫性,慢性炎症和关节破坏密切相关[4-5]。TAZ（Transcriptional co-Activator carrying PDZ binding motif）,又称作携带PDZ结合基序的转录共激活因子,是Hippo信号通路的下游效应因子[6-7]。TAZ已被证明在多种人类癌症和免疫系统疾病的细胞迁移、侵袭和上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal Transition,EMT）中发挥重要作用[8-9]。TAZ参与RA成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like Synoviocyte,FLS）自噬及Th17/Treg分化[1 0-1 1]。课题组前期研究证实,益母草碱能够调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的活化、迁移和侵袭,减轻CIA（Collagen-induced Arthritis,胶原诱导型关节炎）小鼠关节炎症状[1 2]。但益母草碱对RA疾病发展中TAZ的影响尚无报道。因此推测,益母草碱通过TAZ调控炎症反应中细胞因子分泌,FLS活化、迁移和侵袭。为此,本文拟研究益母草碱对TAZ表达的影响,及对炎症细胞因子的调控,以及对活化FLS迁移和侵袭的抑制作用。目的:（1）通过基因库分析类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞差异基因;（2）培养及鉴定CD4+T细胞;研究TAZ对大鼠外周血初始淋巴细胞分化及炎症相关细胞因子的调控作用;（3）研究益母草碱对Th17/Treg平衡、炎症相关细胞因子及TAZ的表达的影响;（4）研究益母草碱调控由白介素-6诱导的成纤维样滑膜细胞炎症迁移、侵袭的分子机制。方法:（1）第一部分:从NCBI基因表达综合（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载有关基因表达的原始数据（CEL文件）。使用Affymetrix转录组分析控制台分析了Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列（GPL570）。使用Aipufu的R cluster Profiler（版本3.10.1）对差异表达基因进行GO和KEGG途径富集分析。（2）第二部分:取正常SD大鼠外周血,采用梯度离心法分离外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）,磁珠分选法纯化CD4+T细胞。通过流式细胞检测对获得细胞进行分析鉴定。使用慢病毒转染法转染目的基因。采用实时定量PCR检测目的基因的表达,采用蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达。采用流式细胞术检测目的基因对CD4+T细胞极化的影响。采用酶联免疫吸附测定法检测目的基因对细胞因子表达的影响。（3）第三部分:使用细胞增殖检测益母草碱对CD4+T细胞的影响。采用流式细胞术检测益母草碱对TAZ高表达组的CD4+T细胞极化的影响。采用酶联免疫吸附测定法检测益母草碱对TAZ高表达组细胞因子水平的影响。采用实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测益母草碱对TAZ m RNA及蛋白表达水平的影响。（4）第四部分:取大鼠关节滑膜,采用胶原酶消化法培养获得原代FLS细胞。使用IL-6诱导FLS炎症反应。采用体外迁移、侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力,以及益母草碱对炎症FLS细胞迁移、侵袭的影响。采用实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测益母草碱对炎症FLS功能影响的分子机制。结果:（1）RA患者与健康个体比较,发现3425个m RNA在两者之间差异表达。TAZ表达在RA患者的CD4+T细胞中上调。对差异表达基因的GO富集分析发现差异表达基因在细胞因子的负调节、中性粒细胞介导激活的免疫反应及黏膜免疫等生物过程富集。KEGG途径富集分析表明,差异表达基因在各种疾病途径中都富集。（2）大鼠外周血中提取的CD4+T细胞纯度达到90%以上。q RT-PCR结果示:经病毒转染后,实验组TAZ的m RNA表达水平显著升高（P<0.05）,阴性对照组TAZ的m RNA表达水平与正常组无明显差异（P>0.05）。蛋白印迹法（Western Blot,WB）结果示:实验组TAZ蛋白的水平升高（P<0.05）。阴性对照组TAZ的m RNA表达水平与正常组无明显差异（P>0.05）。流式细胞术对转染细胞表型的检测结果示:实验组中Th17细胞比例较正常组上升（P<0.05）,Treg细胞比例较正常组下降（P<0.05）。阴性对照组Th17细胞与Treg细胞的比例与正常组比较无明显差异（P>0.05）。酶联免疫吸附测定（ELISA）对细胞上清进行检测后发现,实验组IL-1β、IL-17、TNF-α表达增多（P<0.05）,IL-10的表达减少（P<0.05）。阴性对照组与正常组比较,结果无明显差异（P>0.05）。（3）细胞增殖检测结果示:10μM和20μM益母草碱对大鼠CD4+T细胞的增殖无明显影响（P>0.05）。流式细胞检测结果示:使用益母草碱干预后,实验组较正常组Th17细胞的分化减少（P<0.05）,Treg细胞分化增多（P<0.05）。并且,使用益母草干预正常组发现,与未加益母草的正常组相比Treg细胞比例上升（P<0.05）,Th17细胞比例下降（P<0.05）。结果呈剂量依赖性。ELISA结果示:经益母草碱处理组,相对于未处理组比较,IL-1β、IL-17、TNF-α表达减少（P<0.05）,IL-10的表达增多（P<0.05）。实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法结果示:加入益母草碱干预的组与未加入益母草碱的组相比较,TAZ的m RNA及蛋白质表达均下降（P<0.05）。并且益母草碱能降低正常组中TAZ的m RNA及蛋白质表达（P<0.05）。（4）FLS细胞体外侵袭、迁移的结果示:在IL-6的刺激下,FLS细胞迁移、侵袭数量较正常组增多（P<0.05）。使用10μM和20μM益母草碱干预的组较0μM益母草碱组FLS细胞迁移、侵袭的数量减少（P<0.05）。实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法结果示:经IL-6刺激,FLS细胞中TAZ,RANKL,RANK的m RNA和蛋白表达均上升（P<0.05）。使用10μM和20μM益母草碱干预的组与0μM益母草碱组比较,FLS细胞中TAZ,RANKL,RANK的m RNA和蛋白表达下降（P<0.05）。并且,结果呈剂量依赖性。结论:（1）TAZ在RA患者的CD4+T细胞中高度表达。（2）实验结果表明,大鼠CD4+T细胞分离成功,TAZ基因转染成功。TAZ的表达能够CD4+T细胞极化,促进Th17的分化,抑制Treg细胞分化。TAZ的表达能够促进炎症反应中促炎因子的生成,抑制抗炎因子的表达。（3）益母草碱能够促进CD4+T细胞分化为Treg细胞,抑制Th17细胞的分化,并且能够抑制促炎细胞因子分泌,促进抗炎细胞因子分泌。益母草碱对CD4+T细胞的作用,是通过抑制TAZm RNA和蛋白质的表达。（4）益母草碱能够逆转由IL-6诱导的FLS炎症,通过抑制TAZ/RANKL/RANK信号通路调控FLS体外迁移及侵袭。