《神农本草经》中记载,我国是世界上最早认识并研究甘草的国家,甘草属豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralesis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza infata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)的根和根茎,又名甜草,是我国医药管理部门作为药用植物而收载和管理的四大药材之一,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效,被广泛应用于临床配方。药理研究主要集中在甘草酸、甘草次酸、总黄酮、单种黄酮及多糖等化合物,其中甘草酸是甘草的主要药效成分,其含量是我国2015年版《中国药典》规定的含量测定项之一。研究表明,近年来栽培甘草普遍甘草酸含量较低,达不到2015年版《中国药典》标准,严重制约甘草资源的可持续发展和利用。因此,明确甘草中各成分代谢之间的调控关系,同时提高甘草中各药用成分的含量,对提高甘草品质有着非常重要的意义。已有研究表明,甘草酸生物合成途径不是孤立存在的,它与其他次生代谢产物如脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)、甘草苷(Liquiritin)、甘草素(Liquiritigenin)等生物合成途径相互连接并构成网络。本实验室的前期研究发现,外源喷施适当浓度的ABA能够提高甘草中甘草酸的含量,9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-Cis-Epoxycarotenoid Dioxygenase,NCE)基因是 ABA 合成途径中的限速酶基因之一,其表达量直接影响ABA的合成。即NCED基因是脱落酸合成途径中的关键限速酶基因,其表达量的差异对ABA的积累有着显著的影响,且外援喷施ABA及植物内源ABA的含量差异均能促进甘草酸的积累,即说明NCED基因表达量差异能够影响甘草酸生物合成酶的活性,最终调控甘草酸合成量。本实验室研究还将甘草NCEDs3个基因NCED1、NCED3及NCED4的SNPs位点分别与脱落酸及甘草酸含量进行灰色关联分析,根据结果初步认定在NCED1、NCED3及NCED4三个基因中,NCED1基因变异位点对取样时期ABA合成与积累总的作用要优于NCED3、NCED4,但NCED3、NCED4两个基因对ABA合成与积累也具有一定作用。进一步发现3个基因中NCED1基因437bp(G>A)与甘草酸含量关联系数最大,NCED3基因966bp(G>A)和NCED4基因845bp(A>G)次之,即认为在进行高甘草酸种质的筛选时应优先考虑NCED1基因437bp处G型,NCED3基因966bp处G型以及NCED4基因966bp处A型。本实验为在此研究基础上进一步验证以上的结论,比较研究调控甘草酸含量的功能基因NCED1、NCED3、NCED 分别过表达下甘草酸合成途径关键酶基因表达量、脱落酸和甘草酸的变化差异。本论文通过瞬时过表达方法,根据NCED1、NCED3、NCED4三个基因对甘草酸合成关键酶基因表达量、脱落酸以及甘草酸含量的不同影响,筛选出NCEDs高效成员,为在分子调控水平上提高甘草酸含量和转基因甘草研究提供理论依据;同时构建NCEDs原核表达体系,诱导出可溶性蛋白并纯化,为实验室今后进一步在原核表达基础上验证NCEDs功能奠定了基础。目前取得的主要成果如下:(1)从高甘草酸甘草植株中克隆出来NCEED1、NCED3、NCED4基因,连接pMD-19T克隆载体,成功转入E.coliDH5α感受态细胞,冻存于-80℃。(2)本文成功构建根特异性通用表达载体并在此基础上构建携带NCED1、CEED3和NCED4基因的根特异性表达载体采用T4连接酶连接的方法进行根特异性通用表达载体的构建,按照保护碱基的原则设计引物,将改造后的合成的TobRB7启动子片段连接到载体pCAMBIA1305.1的Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ两个酶切位点之间,并成功的转入大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中。PCR验证及测序验证的结果均表明,根特异性通用表达载体pCA1305.1-7obRB7构建成功。在根特异性通用表达载体的基础上,同样采用T4连接酶连接的方法构建携带NCED1、NCED3和NCED4基因的根特异性表达载体,引物设计原则同上,将NCED1、NCED3、NCED4基因片段分别连接到已经构建成功的根特异性通用表达载体pCA1305.1-TobRB7的Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ两个酶切位点之间,并成功的转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中。PCR验证及测序验证的结果均表明,表达载体pCAM-TToRB7-NCED1/3/4均构建成功。(3)本文成功构建甘草根特异表达工程菌采用电击转化法分别将根特异性表达载体pCA-TTbRB7-NCED1、pCA-TobRB7-NCED3和pCA-TobRB7-NCED4转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中,PCR验证以及测序验证的结果均表明载体已成功转入,即EHA-TobRB7-NCED1、EHA-TobRB7-NCED3 和 EHA-TobRB7-NCED4 均构建成功。(4)本文成功构建农杆菌介导的NCEDs基因瞬时过表达体系本文利用种子吸收法构建农杆菌瞬时表达体系,利用种子自然吸收农杆菌重悬液来瞬时表达外源基因的方法,菌液侵染后,GUS染色结果表明,侵染5天后第一次出现蓝色斑点,侵染14天后蓝色斑点消失,未用农杆菌侵染的甘草苗GUS染色未见蓝色斑点,证明农杆菌侵染成功。(5)对瞬时过表达后的甘草进行甘草酸关键酶基因β-AS的表达量、脱落酸含量以及甘草酸含量的检测以及差异分析本文利用荧光定量PCR的方法检测工程菌EHA-TobRB7-NCED1、EHA-TobRB7-NCED3、EHA-TobRB7-1NCED4侵染后的甘草苗中的甘草酸关键酶基因β-AS的表达量变化,结果证明不同工程菌侵染的甘草和对照组甘草中β-AS基因表达量之间存在着显著性差异(P<0.05),未用工程菌处理的甘草组中β-AS基因表达量最低,工程菌处理后组后的β-AS基因表达量显著提高,且提高程度为:EHA-TobRB7-NCED1>EHA-TobRB7-NCED3>EHA-TobRB7-NCED4。利用酶联免疫方法分别测定工程菌EHA-TobRB7-NCE1/NCED3/NCED4侵染组甘草和未用工程菌侵染组甘草中的内源脱落酸含量,结果表明,未用菌液侵染组甘草中内源脱落酸含量最低,用工程菌EHA-TobRB7-NCED1/NCED3/NCED4侵染的甘草中,内源脱落酸含量高低为:EHA-TobRB7-NCED1>EHA-TobRB7-NCED3>EHA-TobRB7-NCED4。利用HPLC分别测定工程菌EHA-TTbRB7-NCED1/NCED3/NCED4侵染组甘草和未用菌液侵染组甘草中的甘草酸含量,结果表明,未用菌液侵染组甘草中甘草酸含量最低,用工程菌EHA-TobRB7-NCED1/NCED3/NCED4侵染的甘草中,甘草酸含量高低为:EHA-TobRB7-NCED1>EHA-TobRB7-NCED3>EHA-TobRB7-NCED4。以上结果说明3个基因中NCED1基因序列437bp处G型的对本取样时期内β-AS基因表达量、内源脱落酸和甘草酸合成与积累总的作用要优于其他两个基因,NCED3基因序列966bp处G型次之,NCED4基因序列845bp处A型最弱,但NCED3和NCED4对内源脱落酸和甘草酸的合成与积累也具有一定的作用。所以在进行甘草酸种质筛选时或进行转基因甘草研究时应优先考虑的变异位点为NCED1基因序列437bp处G型,NCED3基因序列966bp处G型及NCED4基因序列845bp处A型。(6)首次成功诱导出NCED1、NCED4可溶性蛋白并成功纯化,诱导出NCED3包涵体蛋白并成功纯化本文在既往研究的基础上优化了诱导条件,利用优化后的诱导条件即0.2mM IPTG,16℃、过夜诱导含有 pET-30a(+)-NCED1/NCED3/3NCED4重组质粒的 BL21(DE3)菌株,使目的蛋白得到表达,根据SDS-PAGE电泳结果分析可知,pET-30a(+)-NCED1和pET-30a(+)-NCED4诱导后表达出可溶性蛋白,而pET-30a(+)-NCED3诱导后表达为包涵体。利用不同浓度的咪唑对诱导出的蛋白进行纯化,根据纯化后的SDS-PAGE电泳结果分析可知,pET-30a(+)-NCED1和pET-30a(+)-NCED4诱导表达出的蛋白在咪唑浓度为300mM时洗脱产生较为纯净单一的蛋白条带,之后选择对浓度为300mM咪唑洗脱下来的溶液进行超滤,超滤后的蛋白冻存。pET-30a(+)-NCED3诱导后表达为包涵体,经过尿素复性后,在咪唑浓度为100mM时洗脱产生较为纯净单一的蛋白条带,之后选择对浓度为100mM咪唑洗脱下来的溶液进行超滤,超滤后的蛋白冻存,为实验室今后进一步在原核表达基础上验证NCEDs功能奠定了理论基础。